蛋白質(zhì)N末端組學(xué)研究進(jìn)展

王志強(qiáng)，張瑤，洪學(xué)傳，徐平

1 武漢大學(xué)藥學(xué)院 組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 4300722 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 （北京） 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 1022063 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

綜 述

蛋白質(zhì)N末端組學(xué)研究進(jìn)展

王志強(qiáng)1，2，張瑤2，3，洪學(xué)傳1，徐平1，2

1 武漢大學(xué)藥學(xué)院 組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072
2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 （北京） 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 102206
3 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

王志強(qiáng)， 張瑤， 洪學(xué)傳， 等. 蛋白質(zhì)N末端組學(xué)研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào)， 2016， 32（8）: 1001-1009.

Wang ZQ， Zhang Y， Hong XC， et al. N-terminomics: proteomic strategies for protein N-terminal profiling. Chin J Biotech， 2016，32（8）: 1001-1009.

蛋白質(zhì)的 N末端作為合成的起始，其氨基酸序列組成及翻譯后修飾直接影響著蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)定位，調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，甚至決定了這些蛋白質(zhì)的命運(yùn)。對蛋白質(zhì) N末端組學(xué)的系統(tǒng)研究不僅可以揭示 N末端區(qū)域?qū)φ麄€(gè)蛋白質(zhì)的重要作用，有助于我們深入地了解蛋白質(zhì)在各種生命活動中所扮演的角色，同時(shí)在實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組高覆蓋、基因組重注釋等方面也有著重要的價(jià)值。本文結(jié)合我們的現(xiàn)有工作，綜述了近年來蛋白質(zhì)N末端組學(xué)的研究進(jìn)展，尤其是一些重要的基于質(zhì)譜的N末端富集技術(shù)和方法。

蛋白質(zhì)組學(xué)，蛋白質(zhì)N末端，質(zhì)譜，富集

蛋白質(zhì)的合成是以mRNA為模板，在核糖體、tRNA以及多種酶的參與下，經(jīng)過翻譯后修飾、信號肽切除等過程形成成熟的蛋白質(zhì)。N末端作為蛋白質(zhì)合成的起始，其序列組成及發(fā)生的翻譯后修飾等影響著整個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。同時(shí)，N末端序列有著很高的特異性，大約有78%-97%的蛋白可以通過測定其前5個(gè)氨基酸來實(shí)現(xiàn)鑒定［1］，這樣極大地減小了蛋白質(zhì)組的復(fù)雜程度，為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組的高覆蓋提供了可能。隨著蛋白質(zhì)基因組學(xué)的興起，利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)對基因組進(jìn)行重注釋逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對蛋白質(zhì)N末端進(jìn)行大規(guī)模的鑒定和分析，有助于我們驗(yàn)證和校正已注釋基因，甚至發(fā)現(xiàn)一些新的基因。近20年，質(zhì)譜技術(shù)經(jīng)歷了快速的發(fā)展，人們對蛋白質(zhì)N末端組學(xué)的研究也更加深入，尤其是一些N末端富集技術(shù)和方法的建立、改進(jìn)，使得蛋白質(zhì)N末端的大規(guī)模測序逐步成熟。本文對近年來蛋白質(zhì)N末端組學(xué)的研究方法特別是一些重要的富集策略進(jìn)行了綜述。

1　蛋白質(zhì)N末端的生物學(xué)意義

蛋白質(zhì)的合成起始于N末端，有時(shí)在翻譯結(jié)束后 （或者過程中） N末端序列會不同程度地發(fā)生翻譯后修飾、信號肽切除、蛋白質(zhì)水解等過程，而這些變化和N末端肽段本身的序列決定著蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，如蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性，甚至最終的成熟［2］。第一，N末端氨基酸序列對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和半衰期有著重要影響。早在1986年，N末端降解因子就被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于多種生物體中［3］。第二，蛋白質(zhì) N末端發(fā)生的翻譯后修飾會影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。比如，N末端乙酰化現(xiàn)象在真核生物體內(nèi)普遍存在，其在蛋白質(zhì)降解［4］、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和定位［5-6］、蛋白質(zhì)復(fù)合體形成［7］等方面發(fā)揮著重要作用。而很多蛋白質(zhì)N末端的谷氨酸殘基或者谷氨酰胺殘基會在相應(yīng)環(huán)化酶的作用下轉(zhuǎn)變成焦谷氨酸殘基，這種翻譯后修飾能夠保護(hù)蛋白質(zhì)不被氨肽酶降解［8］，同時(shí)調(diào)控一些肽類激素和神經(jīng)肽的生物活性［9］。第三，一些蛋白質(zhì)的 N末端含有一段信號肽，它們會影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位，通常在蛋白質(zhì)到達(dá)指定位點(diǎn)后便會被切除［10］。此外，一些蛋白質(zhì)需要發(fā)生水解才能具備生物活性。例如我們常用的胰蛋白酶，它需要切除其保護(hù)基團(tuán)后才能暴露活性位點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能［11］。

因此，對蛋白質(zhì)N末端的測定和分析不僅可以幫助我們明確其一級結(jié)構(gòu)及可能存在的變體形式，為蛋白質(zhì)及其變體的生物學(xué)功能研究及在生理、病理?xiàng)l件下生物學(xué)意義的闡述提供條件，同時(shí)在基因組重注釋方面也有助于我們驗(yàn)證和校正已注釋基因，發(fā)現(xiàn)新的基因編碼特征，從而完善并促進(jìn)基因組學(xué)的研究。

2　蛋白質(zhì)N末端的非質(zhì)譜測序

2.1化學(xué)測序

早在1949年，瑞典有機(jī)化學(xué)家Edman就提出了著名的蛋白質(zhì) N末端測序方法——Edman降解法［12］。其原理是蛋白質(zhì)的N末端氨基酸殘基首先和異硫氰酸苯酯 （PITC） 耦合，形成苯氨基硫甲酰 （PTC） 衍生物后用三氟乙酸 （TFA）從多肽鏈上切下修飾的殘基，再經(jīng)層析鑒定，余下的多肽鏈被回收再進(jìn)行下一輪降解循環(huán)。雖然Edman降解法被其他一些研究者進(jìn)一步發(fā)展和完善［13］，但是其方法本身的限制無法忽視。例如，該法僅適用于一些純度較高的簡單蛋白，面對復(fù)雜樣本便無能為力；其次，Edman降解是以PITC對蛋白質(zhì)N末端氨基的修飾為基礎(chǔ)的，因而難以對N末端已發(fā)生修飾的蛋白進(jìn)行測序；而隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，作為經(jīng)典的N末端測序方法，Edman降解已無法滿足研究者對蛋白質(zhì)N末端的大規(guī)模測序的需求。

2.2算法預(yù)測

隨著基因組測序技術(shù)的日趨成熟，對基因組進(jìn)行自動化的注釋也成為可能。目前已有不少預(yù)測蛋白質(zhì)N末端的算法能夠整合翻譯起始位點(diǎn)、翻譯后修飾以及信號肽切除等信息，例如ProTISA、EasyGene和GeneMarkS等［14-15］，但是并不完善。在真核生物中，翻譯起始位點(diǎn)相當(dāng)保守，但一般的算法仍然難以對其進(jìn)行準(zhǔn)確地預(yù)測［16］。這個(gè)問題在原核生物中更為復(fù)雜，因?yàn)樗惴ū仨毧紤]多個(gè)可能的起始密碼子和核糖體結(jié)合序列［14］，如 Nielsen等［17］對 143個(gè)原核生物的基因組進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，有些基因組的注釋錯(cuò)誤達(dá)到60%，而蛋白質(zhì)N末端的注釋不對等現(xiàn)象更為突出［18］。隨著宏基因組研究的出現(xiàn)，這些軟件在面對復(fù)雜的原核生物群時(shí)，會遇到更大的挑戰(zhàn)［19］。另一方面，不少算法也被專門用來預(yù)測信號肽切除位點(diǎn)，例如SignalP、Signal-3L和Signal-BLAST［20-21］等，這些算法通常根據(jù)N端的疏水區(qū)域和附近的中性氨基酸殘基來定位，因而并不能夠有效區(qū)分信號肽與信號錨以及跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域［20，22］。SignalP 4.0被認(rèn)為是目前較為可靠的信號肽預(yù)測軟件［23］，但通常情況下我們難以實(shí)現(xiàn)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的有效驗(yàn)證。

雖然上述這些預(yù)測算法在不斷地改進(jìn)，但是面對生物體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境以及多種可能的生化反應(yīng)，結(jié)果的準(zhǔn)確性仍舊存在很大的疑問。隨著近20年來質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，其高分辨率、高靈敏度、高通量的特性為很多研究者提供了有力的技術(shù)支持，一些新的基于質(zhì)譜的 N末端測序手段也不斷地被提出并廣泛應(yīng)用。

3　蛋白質(zhì)N末端的特異性富集策略

目前，大多數(shù)鑒定蛋白質(zhì)N末端的方法是基于鳥槍法的研究手段。即首先將蛋白質(zhì)混合物酶解為大量肽段，隨后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢測，最后利用生物信息的方法對樣品中的肽段和蛋白信息進(jìn)行分析。但是，由于復(fù)雜樣品中高豐度蛋白的存在，N末端肽段很容易淹沒在大量高豐度肽段中，這使得直接鑒定蛋白質(zhì)的N末端序列變得困難，甚至無法鑒定。因此，近年來發(fā)展出了不少特異性富集 N末端肽段的方法，大大提高了鑒定N末端肽段的有效性，并且已經(jīng)應(yīng)用到高通量的蛋白組學(xué)研究中。根據(jù)N末端肽段富集策略的不同，我們大致可以將其分為正向富集和反向富集兩類 （表1）。

3.1蛋白質(zhì)N末端的正向富集

表1　蛋白質(zhì)N末端的富集策略Tab le 1 Strategies for N-term inal enrichm ent

正向富集方法主要是利用N末端肽段與酶解后產(chǎn)生的中間肽段的差異來實(shí)現(xiàn)兩者的分離。一類正向富集的策略是在蛋白質(zhì)的N末端加一個(gè)化學(xué)標(biāo)簽，隨后通過特異結(jié)合標(biāo)簽手段富集到N末端肽段。TIMMER等［24］首先對樣本進(jìn)行還原烷基化處理，再利用胍基化反應(yīng)封閉蛋白質(zhì)中所有賴氨酸殘基的 ε氨基，隨后使用NHS-SS-biotin （sulfosuccinim idyl-2-（biotinamido）ethyl-1，3-dithiopropionate） 同N末端的α氨基反應(yīng)，酶解后用鏈霉親和素富集到帶有生物素的N末端肽段。他們將這種策略分別應(yīng)用到酵母、大腸桿菌、鼠、人胚胎腎細(xì)胞和人血清等 5種樣本中，研究了其蛋白質(zhì)水解現(xiàn)象，比如甲硫氨酸切除、信號肽切除以及線粒體運(yùn)輸肽的切除等。另一種類似的做法是用SATA （N-succinimidyl S-acetylthioacetate） 代替NHS-SS-biotin 修飾蛋白的N末端，隨后用一種可和硫醇反應(yīng)的試劑實(shí)現(xiàn)富集［25］。與鏈霉親和素富集法相比，該法的反應(yīng)效率較高，富集的特異性達(dá)到 97%。研究者利用該方法在曲霉菌Aspergillus niger中共鑒定到1 672個(gè)N末端肽段和蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)。Xu等［26］在 Edman降解法原理的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種N-CLAP （N-term inalom ics by chem ical labeling of the α-am ine of proteins） 的N末端富集方法。研究者同樣使用異硫氰酸苯酯 （PITC）封閉所有蛋白質(zhì)的氨基 （包括N末端的α氨基和賴氨酸殘基支鏈上的ε氨基），接著使用三氟乙酸 （TFA） 處理使得蛋白 N末端暴露出 α氨基，和NHS-SS-biotin反應(yīng)后通過親和純化得到N末端肽段。這種方法同Edman降解一樣僅適用于N末端未發(fā)生修飾的蛋白，同時(shí)反應(yīng)步驟較多，增大了N末端肽段損失的可能性，因而富集效果有限。而 Bland等［27］則使用一種可以特異性修飾蛋白N末端的試劑——TMPP （N-tris （2，4，6-trimethoxyphenyl） phosphonium acetyl） 來修飾玫瑰桿菌R. denitrificans的全蛋白，酶解后通過反相液相色譜分為多個(gè)組分，再向每個(gè)組分中加入偶聯(lián)在磁珠上的TMPP抗體來富集N末端肽段。研究者共制備了 10種 TMPP抗體（anti-TMPP1-anti-TMPP10），經(jīng)過篩選與評估，最終選擇anti-TMPP6用作后續(xù)研究。結(jié)果共鑒定到269個(gè)N末端序列，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新基因。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于做法直接，且 TMPP抗體富集的特異性達(dá)到 97%，但是前期抗體的制備與篩選較為繁瑣，使得整個(gè)富集流程較長，難于推廣。

另一類正向富集N末端肽段的方法是利用N末端肽段與中間肽段電荷的不同，通過強(qiáng)陽離子交換 （SCX） 的手段分離得到N末端肽段。這種富集方法通常用于研究 N末端乙?；F(xiàn)象，流程簡單、可操作性強(qiáng)。在真核生物中，大約有 80%的蛋白會發(fā)生 N末端乙?；揎棧?8］。由于乙?；揎椀拇嬖?，酶切后的N末端肽段比中間肽段少帶一個(gè)正電荷，這樣可在強(qiáng)陽離子交換柱中實(shí)現(xiàn)分離。同時(shí)，還可以結(jié)合不同酶 （例如Lys-C和Lys-N） 的特點(diǎn)來提高N末端肽段的覆蓋度［29］。Chen等［30］在上述基礎(chǔ)上引入了雙甲基化標(biāo)記的方法，用于分析HepG2 細(xì)胞的N末端乙?；闆r，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù) N末端乙?；亩卧谇皟蓚€(gè) SCX組分（共8個(gè)組分） 被鑒定到，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些僅在N末端序列上存在差異的蛋白質(zhì)變體，如ERK 1/ERK2、β-actin/γ-actin等。相比化學(xué)修飾的正向富集策略，強(qiáng)陽離子交換的分析手段更為簡捷，但該法僅對如N末端乙?；@樣特定的翻譯后修飾形式適用，難于成為一種N末端蛋白質(zhì)組研究的通用方法。

3.2蛋白質(zhì)N末端的反向富集

盡管蛋白質(zhì) N末端的正向富集方法已有不少應(yīng)用，鑒于其策略本身的局限性 （如大多數(shù)正向富集法依賴于蛋白質(zhì)N末端未被修飾的α氨基），近年來關(guān)于反向富集方法的研究和應(yīng)用更為廣泛。反向富集方法通常是在酶解后去除中間肽段來獲得N末端肽段。其中使用較多的是Gevaert 和Vandekerckhove 在2003年開發(fā)的COFRADIC （Combined fractional diagonal chromatography）法［31］。該方法首先在常規(guī)的還原烷基化后封閉蛋白質(zhì)所有的氨基，隨后第一次反相液相色譜分離為若干組分，再利用一種帶有較強(qiáng)疏水性的試劑TNBS （2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid） 同中間肽段的 α氨基反應(yīng)，二次反相液相色譜分離后得到N末端肽段。該法雖然需要經(jīng)過兩次反相液相色譜分離，但其靈敏度較高，加上與其他技術(shù)和方法的交叉，已發(fā)展成為一種主要的N末端富集方法。例如，Bland等［32］在COFRADIC方法中引入了TMPP，對R. denitrificans進(jìn)行研究，結(jié)果共鑒定到 534個(gè) N末端肽段，包括 5個(gè)新基因和41個(gè)新的翻譯起始位點(diǎn)。Venne等［33］還在COFRADIC方法的基礎(chǔ)上結(jié)合強(qiáng)陽離子交換的分離手段開發(fā)了ChaFRADIC （Charge-based fractional diagonal chromatography） 方法，后者更加簡便易行，靈敏度也更高。在總量為50 μg的樣本中，僅從40%的組分就鑒定到1 459個(gè)N末端肽段，最終共有36個(gè)icp55的底物被鑒定到，包括一個(gè)新的底物Isa2。

另一種較為成熟的反向富集策略是 TAILS （Term inal am ine isotopic labeling of substrates）方法［34-36］，該方法首先用同位素化合物標(biāo)記蛋白質(zhì)中所有的氨基，酶解后利用一種富含醛基的聚合物HPG-ALD除去中間肽段，剩余即為N末端肽段?；诜€(wěn)定同位素標(biāo)記通常有dimethyl-TAILS［36］和 iTRAQ-TAILS［35］兩種定量研究N末端蛋白質(zhì)組的方法，這兩種方法的標(biāo)記效率均比較高，且HPG-ALD聚合物清除中間肽段的能力也較強(qiáng)，因此，TAILS方法被應(yīng)用到多個(gè)研究中。例如，Prudova等［35］利用iTRAQ-TAILS法在鼠胚胎成纖維細(xì)胞中研究了兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的基質(zhì)金屬蛋白酶變體 MMP-2 和MMP-9，結(jié)果共鑒定到201個(gè)MMP-2的酶切產(chǎn)物和19個(gè)MMP-9的酶切產(chǎn)物。同時(shí)，這種方法還被用作研究 MMP-10［37］和鑒定二肽酶DP8和 DP9的內(nèi)源性酶切底物［38］。而 DICAS （Dimethyl isotope-coded affinity selection） 方法［39］的設(shè)計(jì)同TAILS法類似，不同點(diǎn)在于利用另一種含有醛基的基質(zhì) （POROS-AL） 除去中間肽段，但是該法的清除效率較低，因此應(yīng)用前景有限。此外，還有PTAG （Phospho tagging）法［40］，這種方法主要是在中間肽段的N末端添加一個(gè)磷酸化標(biāo)簽，再利用鎳柱除去中間肽段。研究者在奈瑟氏菌Neisseria meningitidis和酵母Sacchoromyces cerevisiae中分別鑒定到753個(gè)和928個(gè)N末端肽段。

3.3其他富集策略

上述COFRADIC方法和TAILS方法是目前較為主流的N端富集方法，而另一種鑒定N末端的方法N-TOP （N-term inal-oriented proteom ic）也有一定應(yīng)用［41］。該法是Gallien等在2009年開發(fā)，首先利用 TMPP修飾恥垢分枝桿菌Mycobacterium smegmatis全蛋白，隨后進(jìn)行1D SDS-PAGE分離，分離后一半使用trypsin酶切，一半使用Asp-N酶切，結(jié)果共鑒定到443個(gè)N末端序列。嚴(yán)格意義上來講，N-TOP方法并不存在富集，但其與 TMPP的結(jié)合同樣能夠?qū)崿F(xiàn)N末端肽段的有效鑒定。TMPP之所以會在 N末端富集策略中備受青睞，原因大致有以下幾點(diǎn)：1） 在pH 8.2時(shí)，TMPP能夠特異地和蛋白質(zhì)N末端的α氨基反應(yīng)，為后續(xù)的富集奠定了基礎(chǔ)；2） TMPP本身帶有+1價(jià)，有效提高了肽段的離子化效率［42］，彌補(bǔ)了N末端肽段豐度低的劣勢；3） TMPP修飾肽段的疏水性增強(qiáng)，多在反相液相色譜中保留時(shí)間較大的位置出現(xiàn)，降低了肽段的復(fù)雜程度；4） TMPP修飾后的肽段在質(zhì)譜中的二級碎裂主要以a、b離子為主，譜圖較為干凈，利于鑒定［43］。之后 Bertaccini等［44］在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了dN-TOP （Doublet N-term inal oriented proteom ics） 的方法，即利用輕、重同位素標(biāo)記的 TMPP分別修飾蛋白質(zhì)的N末端，1∶1混合后進(jìn)行LC-MS/MS檢測。這樣不僅提高了N末端蛋白質(zhì)組鑒定的準(zhǔn)確性，還能夠達(dá)到定量的目的。

作者所在的實(shí)驗(yàn)室也開展了N末端蛋白質(zhì)組的研究工作。如我們將泛素 （Ubiquitin） 作為模型蛋白，分析TMPP修飾前后其N末端序列（MQIFVK） 在色譜和質(zhì)譜行為上的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TMPP修飾后的N末端序列（TMPP-MQIFVK） 在反相液相色譜中的保留時(shí)間明顯增大，這表明 TMPP基團(tuán)能夠顯著增強(qiáng)N末端序列的疏水性；同時(shí)，在高能碰撞誘導(dǎo)碎裂 （HCD） 模式下，其二級碎裂結(jié)果不同于常規(guī)的b、y離子序列，而主要表現(xiàn)為a、b離子序列。TMPP的這兩個(gè)特點(diǎn)為我們下一步在反相液相色譜梯度優(yōu)化、質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化以及譜圖過濾等方面提供了重要信息，有利于N末端肽段的分離、鑒定和確認(rèn)。隨后，我們利用TMPP修飾模式生物S. cerevisiae的全蛋白，并嘗試了不同的蛋白酶 （如 Lys-N） 對上述樣本進(jìn)行酶切，結(jié)合強(qiáng)陽離子交換的分離手段，探索新的高效分離N末端肽段的方法，實(shí)現(xiàn)N末端肽段的正向富集 （另文發(fā)表）。

綜上所述，雖然近年來對蛋白質(zhì)N末端組學(xué)的研究在持續(xù)發(fā)展，各種富集策略也在不斷地被提出、改進(jìn)，但是從總體情況來看，N末端的覆蓋度仍舊比較低［21］。歸納起來，大致有內(nèi)源和外源兩方面的原因。內(nèi)源性的原因主要有以下幾點(diǎn)：1） 相對于整個(gè)蛋白質(zhì)組來說，N末端肽段的比例較低；2） 有些N末端肽段特殊的理化性質(zhì)使其難以被質(zhì)譜檢測，如分子量小、離子化效率低等因素［40］；3） N末端肽段存在的多種翻譯后修飾不利于化學(xué)標(biāo)記。外源性的原因主要是在富集過程中產(chǎn)生的，有三個(gè)方面：1） 樣品會在提取、制備以及標(biāo)記過程中發(fā)生降解；2） 富集過程會增加樣品的復(fù)雜程度和N末端肽段的損失；3） 不完全的標(biāo)記和富集會影響N末端肽段最終的收率。

4　小結(jié)與展望

目前，基于蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究蛋白質(zhì)N末端逐漸地走向成熟，并且已經(jīng)展現(xiàn)出其在蛋白質(zhì)N末端的鑒定、定量以及揭示蛋白質(zhì)生物學(xué)功能方面的重要價(jià)值。這不僅幫助我們清楚地了解蛋白質(zhì)N末端的氨基酸序列、所發(fā)生的翻譯后修飾等信息，同時(shí)也提示我們進(jìn)一步探究更為復(fù)雜的生命現(xiàn)象。雖然當(dāng)前研究蛋白質(zhì)N末端組學(xué)的技術(shù)和富集手段并不完善，但是隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，針對蛋白質(zhì)N末端組學(xué)開發(fā)出更加有效的材料、試劑甚至全新的理論和策略，尤其是一些預(yù)測算法的逐步改進(jìn)和成熟，我們一定會用更短的時(shí)間得到更加可靠、更加全面的N末端信息，從而使我們能夠更加深入地了解蛋白質(zhì)N末端在整個(gè)生命活動中所發(fā)揮的重要作用。

REFERENCES

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（本文責(zé)編 陳宏宇）

October 20， 2015； Accepted: November 24， 2015

Ping Xu. Tel: +86-10-61777113； Fax: +86-10-80705155； E-mail: xupingghy@gmail.com

N-term inom ics: proteom ic strategies for protein N-term inal profiling

Zhiqiang Wang1,2, Yao Zhang2,3, Xuechuan Hong1, and Ping Xu1,2

1 Key Laboratory of Combinational Biosynthesis and Drug Discovery (Wuhan University)， M inistry of Education， School of Pharmaceutical Science， Wuhan University， Wuhan 430072， Hubei， China
2 National Engineering Research Center for Protein Drugs， Beijing Proteome Research Center， National Center for Protein Sciences，State Key Laboratory of Proteomics， Beijing Institute of Radiation Medicine， Beijing 102206， China
3 Institute of Microbiology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China

Protein N-term ini， as the beginning of translation， has a major impact on protein's biological functions. Its sequence and various post-translational modifications often affect protein activation， stability and cellular-localization，regulate the signal transduction， and even determ ine protein's final destiny. The systematic study of protein N-term ini can clarify the vital function of the N-term inus， and provide in-depth know ledge of the multifunctional roles that protein has played in diverse biological processes. In addition， N-term inal research may help us to achieve high-coverage proteom ics and re-annotate genom ics. Combined w ith our own research， this review highlights recent progress of N-terminom ics，especially some important enrichment strategies and technologies based on mass spectrometry.

proteomics， protein N-termini， mass spectrometry， enrichment

Supported by: National Natural Science Foundation of China （Nos. 31400697， 31470809， 31400698）， National Natural Science Foundation of Beijing （Nos. 5144027， 5152008）， Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program （No. 2012BAF14B00）.

國家自然科學(xué)基金 （Nos. 31400697， 31470809， 31400698），北京市自然科學(xué)基金 （Nos. 5144027， 5152008），國家重大儀器專項(xiàng) （No. 2012BAF14B00） 資助。

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