淫羊藿女貞子對糖皮質激素性骨質疏松大鼠糖皮質激素受體作用的影響

楊　燕　年宏蕾　劉仁慧，2　王秀娟.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京　00069；2.中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京　00069

淫羊藿女貞子對糖皮質激素性骨質疏松大鼠糖皮質激素受體作用的影響

楊燕1年宏蕾1劉仁慧1，2王秀娟1
1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京100069；2.中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京100069

目的 研究淫羊藿女貞子煎劑及其有效成分提取物配伍對糖皮質激素性骨質疏松（GIOP）大鼠糖皮質激素（GC）及糖皮質激素受體（GR）的影響。方法 SPF級雄性SD大鼠60只，隨機分為正常對照組（N組）、模型對照組（M組）、淫羊藿女貞子煎劑高、低劑量組（7、3.5 g/kg，YN高、低劑量組），淫羊藿女貞子提取物高、低劑量組（200、100 mg/kg，YNE高、低劑量組），每組10只。除N組外，大鼠兩大腿內側交替肌內注射地塞米松（1 mg/kg），每周2次，8周后，采用酶免法檢測血清皮質酮（CORT）及GR含量，流式細胞術檢測股骨GR蛋白表達量及結合力。結果與N比較，M組血清CORT及GR含量顯著降低 （P＜0.01），股骨GR蛋白表達量及結合力顯著升高（P＜0.01）。與M組比較，4個給藥組均能顯著增加血清CORT及GR含量（P＜0.01），下調股骨GR蛋白表達量（P＜0.01）；YN高劑量組與YNE高、低劑量組能顯著降低股骨GR蛋白結合力（P＜0.01）。結論 淫羊藿女貞子抗GIOP的作用機制與抑制GR在骨組織的表達、降低GC對骨組織的作用有關。

骨質疏松；糖皮質激素；糖皮質激素受體；淫羊藿/女貞子

［Abstract］Objective To investigate the effects of combination of the decoction and active ingredients of Epimedii Folium and Fructus Ligustri Lucidi on glucocorticoid（GC）and its receptor（GR）in glucocorticoid-induced osteoporosis （GIOP）rats.Methods 60 male SD rats were randomly divided into 6 groups：the normal group（N group），the model group（M group），the decoction combination of Epimedii Folium and Ligustri Lucidi Fructus groups（7，3.5 g/kg，YN high dose group，YN low），and the extract combination groups（200，100 mg/kg，YNE high dose group，YNE low does group），each group had 10 rats.Except the N group，all rats received intramuscular injection of Dexamethasone（1 mg/kg）twice a week to establish osteoporosis model.After eight weeks，serum CORT and GR were detected by ELISA.The content and the binding force of GR in bone tissue were detected by flow cytometry.Results Serum CORT and GR in the M group were lower than the N group（P＜0.01），while the content and the binding force of GR in bone tissue were higher （P＜0.01）.Compared with the M group，the levels of serum CORT and GR increased in all the treatment groups（P＜0.01），while the expression of GR protein deceased in bone tissue（P＜0.01）.The binding force of GR in bone tissue reduced in the YN high dose group group（7 g/kg）and YNE high dose group，YNE low dose group（P＜0.01）. ConclusionThemechanismofthecombinationof Epimedii Folium and Fructus Ligustri Lucidi in treating GIOP may be related to the inhibition of GR expression in bone tissue and reducing the effect of GC on the bone.

［Key words］Osteoporosis；Glucocorticoid；Glucocorticoid receptor；Epimedii Folium/Fructus Ligustri Lucidi

糖皮質激素（glucocorticoid，GC）由于其良好而有效的抗炎、抗病毒、免疫等多種藥理作用，被廣泛應用于抗移免疫排斥、自身免疫疾病及腫瘤治療等領域［1-2］。但長期大劑量使用GC治療疾病同時會出現(xiàn)激素抵抗、激素依賴以及局部和全身性副作用。糖皮質激素性骨質疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是其引發(fā)的最嚴重副作用之一，發(fā)病率超過50%［3］。GC作用（包括藥理作用及毒副反應）的發(fā)揮，主要是由糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）介導實現(xiàn)的［4］?；谥嗅t(yī)對GIOP病機主要為“腎精不足，陰陽兩虛”的認識，課題組前期應用“陰陽雙補，益精壯骨”之淫羊藿女貞子配伍防治GIOP大鼠骨代謝異常具有良好的作用［5-6］。有研究表明，GR是陰虛、陽虛證的共性蛋白之一［7-8］，但其在GIOP發(fā)病中的變化尚未有研究報道。本研究主要通過觀察淫羊藿女貞子配伍對GR及皮質酮 （corticosterone，CORT）的影響作用，探索淫羊藿女貞子煎劑及其提取物預防GIOP的保護機制，為中藥防治GIOP提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠60只，3月齡，體重（200±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012-0001。SPF級動物環(huán)境，自由飲水、攝食。

1.2儀器

流式細胞儀（FACS Calibur，美國BD公司）；全自動多功能酶標儀（Multiskan MK3，美國THERMO公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH6000II，天津泰斯特儀器有限公司）；低溫離心機（Sigma3K15，北京五州東方科技發(fā)展有限公司）；電子天平（SQP，賽多利斯科學儀器北京有限公司）；漩渦振蕩器（MH-1，其林貝爾儀器有限公司）。

1.3藥品與試劑

淫羊藿總黃酮類提取物（批號：20150419，含總黃酮以淫羊藿苷計為80%，提取率約為2.5%）、女貞子黃酮和萜類提取物（批號：20150221，含量分別以齊墩果酸和蘆丁計，總含量＞80%，提取率約為5%）（上海一林生物科技有限公司）；淫羊藿、女貞子中藥材（北京同仁堂）；地塞米松磷酸鈉注射液（國藥集團容生制藥有限公司，批號：1501408-C22）；地塞米松熒光素（Invitrogen，批號：1654506）；GR單克隆抗體（Abcam，批號：GR138021-1）；TRTIC標記熒光二抗（Abcam，批號：709239）；FITC-GR二抗（Abcam，批號：ab51379）；Ⅰ型膠原酶（Sigma）；0.25%胰蛋白酶消化液（凱基生物，批號：20150817）；大鼠血清CORT酶免試劑盒（美國BG公司，批號：20150918）；大鼠血清GR酶免試劑盒（美國BG公司，批號：20150918）。

1.4實驗方法

1.4.1分組SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法分為6組，每組10只。包括正常對照組（N組），模型對照組（M組），淫羊藿女貞子煎劑高（YN高劑量組）、低劑量組（YN低劑量組），淫羊藿女貞子提取物高（YNE高劑量組）、低劑量組（YNE低劑量組）。

1.4.2藥物制備 淫羊藿水煎液：適量稱取淫羊藿飲片，首煎加8倍體積的水浸泡1 h后加熱煮沸，文火保持沸騰30 min，攪拌、趁熱濾取藥液；藥渣再加原藥量6倍的水加熱煮沸，改文火續(xù)煎30 min后過濾，合并兩次藥液，濃縮至含生藥0.35 g/mL，4℃保存。女貞子水煎液煎藥方法同上。

1.4.3造模與給藥參考文獻［9］，除N組外，各組大鼠分別給予兩大腿內側交替肌內注射地塞米松1 mg/kg，每周2次，共計8周，N組大鼠給予等體積的生理鹽水。造模的同時，各組動物給予相應的藥物，YN高、低劑量組分別給予淫羊藿女貞子（4∶3）煎劑7、3.5 g/kg灌胃；YNE高、低劑量組分別給予淫羊藿女貞子有效成分提取物（2∶3）200、100 mg/kg灌胃；N組、M組，灌服等體積的生理鹽水，每日1次。

1.4.4取材及檢測大鼠禁食16 h后，腹腔麻醉，腹主動脈取血，離心取血清，按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測血清CORT、GR含量。完整分離大鼠左側股骨，剔除所附著的肌肉和結締組織，用PBS沖洗2次，將骨片剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，無EDTA 0.25%胰酶37℃水浴消化20～30 min，吸棄上清，骨片加入0.1%Ⅱ型膠原酶，37℃水浴消化2次，每次1 h，收集上清，1000 r/min離心10 min，收集骨細胞沉淀。參考文獻［10］，以流式細胞術檢測骨組織GR蛋白表達量及GC-GR蛋白結合力。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較根據(jù)方差齊性檢驗結果選擇LSD-t（方差齊）或Tamhane's T2（方差不齊）檢驗；相關分析采用Pearson相關法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠血清CORT及GR含量比較

與N組比較，M組血清CORT及GR含量均顯著降低（P＜0.01）；與M組比較，4個給藥組血清CORT 及GR含量均顯著升高（P＜0.01）。此外，YN高劑量組血清GR含量較YN低劑量組顯著升高 （P＜0.05）。見表1。

表1　各組大鼠血清CORT及GR含量比較（ng/mL，±s）

表1　各組大鼠血清CORT及GR含量比較（ng/mL，±s）

注：與N組比較，**P＜0.01；與M組比較，△△P＜0.01；與YN低劑量組比較，▲P＜0.05；CORT：皮質酮；GR：糖皮質激素受體

組別　只數(shù)　CORT　GR N組M組YN低劑量組YN高劑量組YNE低劑量組YNE高劑量組10 10 10 10 10 10 9.6161±1.0801 4.7301±0.3718**6.7198±0.9210△△7.6024±0.6251△△7.3974±1.0468△△7.7598±0.9358△△3.2654±0.3564 1.4068±0.1590**2.0154±0.1874△△2.6266±0.4087△△▲2.7887±0.3173△△3.2679±0.4155△△

2.2各組大鼠骨組織GR蛋白表達量及GR結合力的比較

與N組比較，M組大鼠骨組織GR蛋白表達量、GR蛋白結合力均顯著升高（均P＜0.01）；與M組比較，4個給藥組均能顯著抑制骨組織GR蛋白表達量（P＜0.01或P＜0.05）；除YN低劑量組以外，其余3個給藥組均能降低大鼠骨組織GR蛋白結合力（均P＜0.01）。見表2。

表2　各組大鼠骨組織GR蛋白表達量及GR結合力的比較（±s）

表2　各組大鼠骨組織GR蛋白表達量及GR結合力的比較（±s）

注：與N組比較，**P＜0.01；與M組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；CORT：皮質酮；GR：糖皮質激素受體

組別　只數(shù)　GR蛋白表達量　GR蛋白結合力N組M組YN低劑量組YN高劑量組YNE低劑量組YNE高劑量組666666 2007.17±457.56 3619.33±229.00**2870.50±656.99△2662.67±397.94△△2614.17±756.49△△2229.17±369.94△△3238.33±692.49 6465.33±418.45**5785.17±487.56 5534.50±789.18△△4826.83±579.88△△4347.00±435.92△△

2.3大鼠血清CORT、GR與骨組織GR的相關性分析

相關性分析顯示：血清CORT含量與血清GR含量呈顯著正相關（r=0.680，P＜0.01），與骨組織GR蛋白表達量和結合力呈顯著負相關（r=-0.483、-0.559，均P＜0.01）；血清GR含量與骨組織GR蛋白表達量和結合力均呈顯著負相關（r=-0.737、-0.753，均P＜0.01）；骨組織GR蛋白表達量和結合力呈顯著正相關（r= 0.648，P＜0.01）。見表3。

表3　大鼠血清CORT、GR與骨組織GR的相關性分析（r值，n=36）

3　討論

對于GIOP的防治，目前西醫(yī)并沒有理想藥物，臨床用藥常借鑒原發(fā)性骨質疏松癥（osteorosis pathology，OP）的治療，大多數(shù)學者主張聯(lián)合使用鈣制劑和維生素D，但系統(tǒng)評價遠期療效（36個月后）不顯著。中醫(yī)認為GC為外源性“純陽”“邪熱”之品，長期服用，致火旺傷陰，日久累及腎陽，使腎中陰陽虧損，腎精虧虛無以充實骨骼，誘發(fā)OP［11-12］。針對GIOP的中醫(yī)病機“腎精不足，陰陽兩虛”，國家級名老中醫(yī)李世增教授經(jīng)多年臨床經(jīng)驗篩選具有 “陰陽雙補，益精壯骨”之功的淫羊藿女貞子藥對，用于GIOP的防治，并取得良好的療效。中藥淫羊藿溫補腎陽、強筋骨，為補陽藥；女貞子滋補肝腎陰精、強腰膝，為補陰藥，二藥配伍，有“陰陽相濟”之妙用。大量研究證實，淫羊藿抗OP作用與其所含的黃酮類物質有關［13-14］，女貞子抗OP的主要成分以黃酮類、萜類為主［15-16］。淫羊藿、女貞子均具有藥用植物分布廣、低毒副作用、價格合理、標本兼治、資源豐富、可長期服用等優(yōu)點，且組方藥味少，有效成分明確。因此，研究淫羊藿女貞子煎劑及其抗OP的有效成分防治GIOP的作用有著良好的開發(fā)和應用前景。

GC誘發(fā)OP的不良反應主要通過GR介導，抑制成骨細胞增殖分化，影響成骨細胞功能，促進成骨細胞凋亡，屬于以骨形成減少為主要特點的低轉換型OP類型［17-18］。GR的功能活性由GR的蛋白表達數(shù)量和GR的配體親和力兩方面因素決定，對于GR在GIOP發(fā)病中的變化目前尚未有文獻報道。結合中醫(yī)的現(xiàn)代研究觀點“GR是腎陰、陽虛證的相關共性蛋白［19-20］”認識，本課題主要觀察GIOP大鼠體內GR的變化，探討淫羊藿女貞子煎劑及提取物對GIOP骨組織的保護機制。本實驗采用流式細胞術檢測骨組織GR蛋白表達量及結合力，結果顯示，GIOP大鼠骨組織中GR蛋白表達量及GR結合力均顯著升高（P＜0.01），提示外源性GC可誘導骨組織高表達GR，且GR與GC的結合敏感性增加。應用淫羊藿女貞子煎劑及提取物治療，均能顯著下調GIOP大鼠骨組織中GR蛋白表達及結合力（P＜0.01或P＜0.05）。骨中GR蛋白數(shù)量及功能的減弱，表明GC對骨組織作用的敏感性降低，防止GC在使用過程中對骨組織產(chǎn)生的不良危害。

文獻研究表明，GC類藥物的超生理劑量或長期應用可抑制腎上腺皮質功能［21-22］，致使機體內源性CORT分泌減少，GR功能減弱，本實驗得出相似的結果。大鼠經(jīng)8周地塞米松造模后，血清CORT、GR含量均顯著降低（P＜0.01），出現(xiàn)GR功能的顯著抑制，從而導致激素用藥的敏感性降低及所發(fā)揮的抗炎等藥理作用減弱。提示激素抵抗的出現(xiàn)，需要加大GC劑量才能夠控制病情，甚至大劑量GC應用也不能奏效，反而導致一系列嚴重的副作用。而應用中藥淫羊藿女貞子后，能顯著增加GIOP大鼠血清CORT、GR含量（P＜0.01），提示藥物能夠保護內源性GC作用途徑，恢復對激素的敏感性，從而可預防激素抵抗的發(fā)生，降低激素用量，這可能為臨床大量相關免疫性疾病治療中的激素應用及激素抵抗的預防提供了有益的啟示。

GC對血中GR含量的影響主要與激素的藥理作用有關，而對骨組織GR的影響作用則與誘導OP的發(fā)生有關。上述研究發(fā)現(xiàn)，GC長期應用能抑制血清GR含量，卻上調骨中GR蛋白表達及結合力，提示GC長期應用，會導致其藥理作用的敏感性降低，但對骨代謝的抑制作用反而增強。相關分析的結果提示，血清CORT含量與血清GR含量呈正相關（P＜0.01），但與骨組織GR蛋白表達量和結合力均呈顯著負相關（P＜0.01）；血清GR含量分別與骨組織GR蛋白表達量及結合力呈負相關（P＜0.01）。進一步驗證了當出現(xiàn)激素耐受時，雖然激素藥理活性降低，但并不影響對骨代謝的副作用，GC誘導OP的副作用是持續(xù)進展的。

綜上所述，中藥淫羊藿女貞子煎劑及提取物通過抑制GR在骨組織中的表達，降低GC對骨的危害，防止GIOP的發(fā)生。同時，還能明顯改善GC對內源性CORT、GR的抑制作用，提高激素作用的敏感性，從而對內源性的GC作用途徑有良好的保護作用，減少激素用量，降低GIOP的發(fā)生。

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Effects of the combination of Epimedii Folium and Fructus Ligustri Lucidi on glucocorticoid receptor in glucocorticoid-induced osteoporosis rats

YANG Yan1NIAN Honglei1LIU Renhui1,2WANG Xiujuan1
1.School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing100069，China；2.Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Collateral Disease Theory Research，Beijing100069，China

R285.5

A

1673-7210（2016）05（b）-0004-04

國家自然科學基金資助項目（81373814）；北京市教育委員會科技計劃面上項目（KM201510025012）；北京中醫(yī)藥薪火傳承“3+3”工程二室一站建設項目（2012-SZ-C-42）。

楊燕（1993-），女，首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院2015級中藥學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：中藥及復方的藥效及作用機制。

劉仁慧（1974-），女，副教授，博士，碩士生導師；研究方向：中藥配伍及藥效學研究。王秀娟（1956-），女，教授，博士生導師；研究方向：中藥藥效與作用機制。

2016-02-10本文編輯：程銘）