英夫利昔單抗對小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制探討

何　懿，韓姣嬋，孫爾維

(南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，廣州 廣東510630)

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英夫利昔單抗對小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制探討

何懿，韓姣嬋，孫爾維*

(南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，廣州 廣東510630)

目的探討英夫利昔單抗(Infliximab)對小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(BMDCs)的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。方法分離6-8周健康C57BL/6小鼠骨髓，刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生未成熟DCs,分別采用0、10 μg/ml、50 μg/ml、250 μg/ml的Infliximab處理BMDCs，檢測其凋亡壞死情況。進(jìn)一步用脂多糖(LPS)刺激，檢測協(xié)同共刺激分子CD40、CD80、CD86和抗原遞呈分子MHCⅡ類抗原表達(dá)情況；Infliximab預(yù)處理BMDCs，再用LPS刺激，用遷移小室進(jìn)行培養(yǎng)，用CCL21對BMDCs進(jìn)行趨化，檢測BMDCs遷移能力的變化。結(jié)果250 μg/ml的Infliximab作用后BMDCs的凋亡壞死明顯增加，因此實驗劑量選用50 μg/ml；Infliximab處理的BMDCs在LPS刺激后，CD40、CD80、CD86及MHCⅡ類抗原表達(dá)下調(diào)；Infliximab處理的BMDCs在LPS刺激后對CCL21的趨化反應(yīng)性下降(P均<0.05)。結(jié)論英夫利昔單抗(Infliximab)通過影響小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(BMDCs)的成熟、遷移來抑制BMDCs對適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動作用，進(jìn)而影響自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。

英夫利昔單抗；樹突狀細(xì)胞；成熟；遷移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1246)

抗原呈遞細(xì)胞(APC)主要功能是對抗原物質(zhì)的攝取、加工，并將抗原肽呈遞給特異性T淋巴細(xì)胞，是啟動免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁[1,2]。樹突狀細(xì)胞(DCs)是目前已知功能最強的APC，在適應(yīng)性免疫的啟動中至關(guān)重要[3]，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[5]、強直性脊柱炎[6]及炎癥性腸病[7]等自身免疫性疾病的發(fā)病中起到重要作用。

腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一個炎癥細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[8]。一些抗TNF-α制劑(如化合物，單克隆抗體等)陸續(xù)被開發(fā)出來用于治療TNF-α相關(guān)疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎及克羅恩病等自身免疫性疾病。英夫利昔單抗(Infliximab)是腫瘤壞死因子單克隆抗體(人鼠嵌合型)，廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及強直性脊柱炎等自身免疫疾病的治療中。但是它對樹突狀細(xì)胞的影響尚未報道。

本研究通過探討英夫利昔單抗(Infliximab)對小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(BMDCs)成熟、遷移的影響來進(jìn)一步明確其免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗動物

6-8周齡SPF級純系雄性C57BL/6小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2藥物與試劑

英夫利昔單抗(Infliximab)購自西安楊森制藥有限公司，脂多糖(LPS)購自Sigma-Aldrich (St.Louis,MO)，重組鼠(rm)-GM-CSF and rm-CCL21 購自PeproTech，CD11c磁珠及柱子，F(xiàn)ITC-AnnexinV 凋亡檢測試劑盒，抗小鼠FITC-CD11c、APC-CD40、PE-CD80、APC-CD86、PE-MHC II 流式抗體及相應(yīng)同型抗體均購自R&D systems，澳洲胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基和PBS購自Gibco，24孔板遷移小室(8.0μm pore size)購自Corning(Acton,MA)。

1.3小鼠BMDCs的分離和培養(yǎng)

小鼠BMDCs的分離和培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。制備骨髓細(xì)胞，第6天，收集半貼壁和懸浮的細(xì)胞，為不成熟BMDCs，遷移試驗中需要用CD11c磁珠純化細(xì)胞，流式檢測純化率>95%。

1.4英夫利昔單抗(Infliximab)對小鼠BMDCs的細(xì)胞毒性分析

將BMDCs用英夫利昔單抗(Infliximab)(超純水溶解)刺激24 h，收集細(xì)胞并按照說明書對細(xì)胞進(jìn)行FITC-AnnexinV/ propidium iodine染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測BMDCs凋亡壞死率。

1.5英夫利昔單抗(Infliximab)對小鼠BMDCs表面共刺激分子表達(dá)的影響

在BMDCs培養(yǎng)的第6天，分別加入LPS(1 μg/ml),Infliximab(50 μg/ml) ,LPS +Infliximab 50 μg/ml培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞，PBS洗兩遍，每管分別加入上述抗小鼠CD11c，抗CD40、抗CD80、抗CD86、抗MHC II及小鼠IgG同型對照抗體各1 μl，陰性對照管不加任何抗體，流式細(xì)胞儀檢測。

1.6英夫利昔單抗(Infliximab)對小鼠BMDCs趨化能力的影響

在BMDCs培養(yǎng)的第6天，離心收集細(xì)胞，用CD11c磁珠對其進(jìn)行純化。純化后的BMDCs用LPS(1μg/ml),Infliximab(50 μg/ml) ,LPS +Infliximab 50 μg/ml作用24 h，分析上述處理過的細(xì)胞對趨化因子CCL21的反應(yīng)能力。CCL21置于24孔板遷移小室的下室，溶于500 μl不含血清的培養(yǎng)基中，使其濃度為200 ng/ml，上述處理過的BMDCs用無血清的培基重懸，置于24孔板遷移小室的上室，為100 μl培基中含2×105個細(xì)胞，在 37℃,5% CO2孵箱中孵育3 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測遷移到下室的BMDCs的數(shù)目。

1.7統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析(One way-ANOVA)。

2　結(jié)果

2.1高濃度英夫利昔單抗(Infliximab)使小鼠BMDCs凋亡壞死率增加

隨著英夫利昔單抗(Infliximab)藥物濃度的增加，小鼠BMDCs凋亡壞死率增加，在濃度達(dá)到250 μg/ml時，BMDCs的凋亡壞死率明顯增加(P<0.05)，但是在50 μg/ml或更低濃度時BMDCs的凋亡壞死率差異不大(見圖1)。

圖1不同濃度(10 μg/ml、50 μg/ml及250 μg/ml)英夫利昔單抗對BMDCs凋亡壞死率的影響 (*P<0.05).

2.2英夫利昔單抗(Infliximab)抑制小鼠BMDCs表面共刺激分子和抗原遞呈分子的表達(dá)

如圖2(A和B)所示，英夫利昔單抗(Infliximab)明顯抑制共刺激分子CD40,CD80,CD86和抗原遞呈分子MHCII的表達(dá)(P<0.05)。說明英夫利昔單抗(Infliximab)可以抑制BMDCs的成熟。

2.3英夫利昔單抗(Infliximab)抑制小鼠BMDCs的遷移

使用遷移小室對BMDCs的遷移能力進(jìn)行研究，如(圖3)所示，LPS刺激后，BMDCs對CCL21的反應(yīng)能力明顯增強，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)目明顯增多。但是，用英夫利昔單抗(Infliximab)處理過的BMDCs對CCL21的反應(yīng)性明顯降低(P<0.05)。說明英夫利昔單抗(Infliximab)可以影響B(tài)MDCs的遷移來抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動。

ctr：對照組,Inf：英夫利昔單抗組； *:LPS組與LPS加英夫利昔單抗組比較，#：LPS組與對照組比較，*P<0.05，#P<0.05，**P<0.01，##P<0.01)

圖2英夫利昔單抗對LPS誘導(dǎo)的BMDCs成熟的影響

ctr：對照組,Inf：英夫利昔單抗組；*:LPS組與LPS加英夫利昔單抗組比較，#：LPS組與對照組比較，**P<0.01，###P<0.001)

圖3英夫利昔單抗對BMDCs趨化的影響

3　討論

DCs是目前已知體內(nèi)最重要的抗原遞呈細(xì)胞，而且也是惟一能激活初始型T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有重要地位[3]。未成熟DCs位于組織和周圍淋巴器官，監(jiān)視和識別外源性和內(nèi)源性抗原，并通過吞噬、微吞飲和胞吞作用攝取抗原。攝取抗原后，未成熟DCs經(jīng)歷成熟過程，同時向周圍淋巴器官遷移。遷移到局部淋巴結(jié)后，DCs將攜帶的抗原物質(zhì)遞呈給T淋巴細(xì)胞進(jìn)而使其活化[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，英夫利昔單抗(Infliximab)能夠可以抑制DCs的成熟和遷移。

眾所周知，T細(xì)胞的活化需兩個信號：第一信號由TCR識別APC表面的抗原肽-MHC復(fù)合物所啟動；第二信號由T細(xì)胞和APC間共刺激分子的相互作用所啟動。兩個信號才可能有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，而缺乏共刺激信號可致T細(xì)胞應(yīng)答下降，某些情況下可誘導(dǎo)耐受或T細(xì)胞失能[12]。骨髓來源的前體細(xì)胞在GM-CSF作用下培養(yǎng)6天分化成未成熟DCs，在LPS作用下誘導(dǎo)為成熟DCs,表現(xiàn)為抗原遞呈分子MHCⅡ和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達(dá)上調(diào)，黏附分子和趨化因子CXCR4等表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMDCs經(jīng)LPS刺激后共刺激分子(CD40、CD80、CD86)和抗原遞呈分子MHCⅡ高表達(dá)，產(chǎn)生成熟DCs。但如果在第6天加入英夫利昔單抗(Infliximab)共培養(yǎng)，則DCs的成熟將受到抑制，表現(xiàn)為共刺激分子及MHCⅡ類分子表達(dá)下調(diào)。

APC是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，APC只有識別、攝取并加工處理了抗原后分化成熟，趨化因子受體CXCR4等表達(dá)上調(diào)[10]，在相應(yīng)趨化因子的誘導(dǎo)下遷移至局部淋巴結(jié)，將抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞后才能激活適應(yīng)性免疫，因此，APC的遷移在適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動中至關(guān)重要。阻斷APC的遷移，則可以阻斷APC與局部淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞相互作用，是局部淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞處于原始狀態(tài)，避免適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，BMDCs經(jīng)LPS刺激后對趨化因子CCL21的趨化反應(yīng)性增強，但英夫利昔單抗(Infliximab)預(yù)處理過的BMDCs的趨化反應(yīng)性減弱，遷移能力降低。

英夫利昔單抗(Infliximab)是一種TNF-a單克隆抗體，用于治療自身免疫性疾病，最初關(guān)于其機(jī)制的研究主要是以TNF-a為靶點，通過中和作用消除體內(nèi)大量TNF-a的炎癥作用，隨著進(jìn)一步打研究，發(fā)現(xiàn)，英夫利昔單抗(Infliximab)可以作用于T淋巴細(xì)胞，上調(diào)Treg的比例[13]，作用于B淋巴細(xì)胞，抑制其產(chǎn)生自身抗體[14]，但關(guān)于對樹突狀細(xì)胞(DCs)等抗原遞呈細(xì)胞(APC)的研究尚未有報道，而抗原提呈細(xì)胞在自身免疫性疾病的發(fā)生中至關(guān)重要，因此，本研究以樹突狀細(xì)胞(DCs)為靶點，研究英夫利昔單抗(Infliximab)的免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，英夫利昔單抗(Infliximab)可以抑制BMDCs的成熟和遷移，從而抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動，抑制自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，為其臨床應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。

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Immunomodulatory effects of Infliximab on maturation and migration of bone marrow derived dendritic cells

HE Yi，HAN Jiao-chan，SUN Er-wei.

(DepartmentofRheumatology,TheThirdAffiliatedHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510630,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Infliximab on maturation and migration of murine bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) and its potential mechanism.MethodsBMDCs were generated in vitro from bone marrow of C57BL/6 mice by being cultured with GM-CSF.For cytotoxicity assay,BMDCs were treated with different concentrations of Infliximab(0,10 μg/ml,50 μg/ml and 250 μg/ml) for 24 h，the rate of apoptosis and necrosis was detected by flow cytometry.For maturation and migration analysis,BMDCs were treated with LPS (1 μg/ml) in the presence of Infliximab.And the expression of CD40、CD80、CD86 and MHCII on BMDCs and the ability of migaration were analyzed by using Flowcytometry.ResultsInfliximab induced significant BMDC apoptosis and necrosis only at concentrations of 250ug/ml or more(P<0.05),but not at the concentrations of 50 μM or less.Infliximab markedly suppressed the expression of costimulatory molecules,such as CD40,CD80,CD86,and MHC class II on the surfaces of the LPS-stimulated DCs.(P<0.05).And aslo Infliximab inhibited the migration of LPS-treated BMDCs in vitro ConclusionInfliximab could suppress the maturation and migration of mouse BMDCs in vitro culture.

Infliximab;dendritic cells;mature; migration

國家自然基金面上項目(81471613)；國家自然基金青年項目(81501417)

1007-4287(2016)08-1246-04

R392.11

A

2016-06-10)