環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測肉及肉制品中的牛源性成分

冼鈺茵,易敏英，張　璜,高東微,凌　莉,*

(1.廣東檢驗檢疫技術中心,廣東廣州 510623;2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東廣州 510623;3.廣州迪澳生物科技有限公司,廣東廣州 510663)

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環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測肉及肉制品中的牛源性成分

冼鈺茵1,2,易敏英1,2，張璜3,高東微1,2,凌莉1,2,*

(1.廣東檢驗檢疫技術中心,廣東廣州 510623;2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東廣州 510623;3.廣州迪澳生物科技有限公司,廣東廣州 510663)

本文以牛源性線粒體細胞色素B(cytB)基因為模板,采用軟件Primer Explorer Version 4設計并篩選出LAMP特異性擴增引物,通過反應體系優(yōu)化建立了肉及肉制品中牛源性成分的環(huán)介導等溫擴增技術檢測方法,對該方法的靈敏度、特異性以及穩(wěn)定性進行了驗證,同時采用國標方法和商品化檢測試劑盒對市售的12種牛肉及牛肉制品進行對比檢測。結果表明該檢測方法具有高靈敏度、高特異性和高穩(wěn)定性,適用于實際的生鮮肉制品及加工肉制品中牛源性成分的鑒定。

環(huán)介導等溫擴增,檢測,肉及肉制品,牛源性成分

1986年始發(fā)于英國的瘋牛病及其隨后在歐洲地區(qū)的傳播使動物源性成分的使用與控制受到人們越來越多的關注與重視。為了有效地管理與控制動物源性成分，尤其是敏感性反芻動物源性成分在飼料、化妝品及食品中的使用,我國先后出臺了各級標準[1-4],其中牛源性成分的監(jiān)控更是重中之重。

基于宗教信仰、飲食風俗及價格等因素的影響,多個國家與地區(qū)均要求肉及肉制品的食品標簽必須真實明確地標明肉類來源。目前市場上肉類摻假的現(xiàn)象層出不窮,2013年席卷歐洲的馬肉風波僅是冰山一角，以次充好、在高價肉中摻雜低價肉甚至病死肉、變質肉等違法行為屢禁不止,甚至在某些市場銷售的散裝肉制品中根本不含動物源性成分,只通過淀粉與食品添加劑仿制出肉的味道來欺騙消費者,這些摻假行為均嚴重侵害了消費者的合法權益,也對肉及肉制品的質量安全構成了嚴重威脅[5]。研發(fā)高效、快速、準確地鑒別肉及肉制品中動物源性成分的檢測方法,刻不容緩。

表2　牛源性成分的引物序列

環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)是Notomi等人發(fā)明的一種新型核酸檢測技術,該技術成本低,操作簡單,特異性強[6],目前已在生物、醫(yī)學、公共衛(wèi)生及食品安全等技術領域中得到了廣泛應用[7-10]。本文根據(jù)基層實驗室日常檢驗和進出口現(xiàn)場檢驗的條件與需求，選取人類主要的食用牛種-黃牛、水牛和牦牛為目標牛源性成分，以具有高度保守性的線粒體細胞色素B基因為靶基因,建立了牛源性成分快速檢測的LAMP檢測方法,該技術檢測效果良好,且與國家標準方法相比,具有較高的符合率。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗樣品相關信息見表1,實際樣品的檢測,三種方法對比,其中10～12為肉制品。

Promega Wizard?核酸裂解液北京盈田卓越科技有限公司;Precision System Science MagDEA DNA提取試劑盒艾拓思科技有限公司;Ex Taq和dNTPs寶生物工程(大連)有限公司;甜菜堿、Bst DNA聚合酶和10×Thermo Pol緩沖液Sigma 公司;1000×SYBR GreenⅠ廈門百維信生物科技公司。

實時熒光定量PCR儀美國,ABI 7900;核酸提取儀Magtration System 12GC日本,Precision System Science;核酸蛋白分析儀Nanodrop 1000美國,Thermo Scientific。

表1　實驗樣品相關信息

1.2實驗方法

1.2.1DNA模板的制備實驗樣品均采用試劑盒提取DNA,并用核酸蛋白分析儀測定DNA的純度和濃度后,將DNA溶液到稀釋100 ng/μL,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的設計與合成根據(jù)NCBI上公布的牛源性cytB基因序列(登錄號:KJ193457.1),采用LAMP專用引物設計軟件Primer Explorer Version 4設計并篩選出牛的特異性LAMP引物,由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表2。

1.2.3LAMP方法的建立以黃牛、水牛和牦牛的DNA模板作為模板,以TAKARA牛源性成分檢測試劑盒中的Reagent Control作為陽性對照,初步確定25 μL的LAMP反應體系,其成分包括:1×Thermol Pol緩沖液、外引物F3和B3各0.2 μmol/L、內引物FIP和BIP各1.6 μmol/L、環(huán)狀引物FLP和BLP各0.8 μmol/L、1.6 mmol/L dNTPs、1 mol/L甜菜堿、6 mmol/L MgSO4、8 U Bst大片斷DNA聚合酶、10×SYBR GREEN I熒光染料0.5 μL、DNA模板200 ng。

將混合物置于熒光PCR儀中實時監(jiān)控擴增反應,熒光PCR儀反應程序為:Holding Stage為 63℃ 30 s,1個循環(huán);Cycling Stage 為63℃ 15 s,63℃ 45 s,45個循環(huán),于63℃ 45 s處收集熒光信號,熒光通道為SYBR。

1.2.4LAMP反應體系和反應條件的優(yōu)化根據(jù)上述LAMP反應的實驗結果,通過改變dNTPs、甜菜堿及Mg2+的濃度以及反應時間對LAMP反應條件進行優(yōu)化,以確定最佳的反應體系和反應條件。

1.2.5特異性實驗分別提取豬肉、水牛肉、黃牛肉、牦牛肉、山羊肉、綿羊肉、馬肉及驢肉等共計31種樣品的總DNA,利用上述的反應體系和條件配制相應的反應液,利用熒光PCR儀檢測,確定該檢測方法的特異性。

1.2.6靈敏度實驗把牛源性DNA模板稀釋到100 ng/μL,按體積比分別混合成10%,5%,1%,0.5%,0.1%五份陽性模擬樣品,進行LAMP擴增,通過峰圖評價本文所建立的LAMP的方法靈敏度。

1.2.7穩(wěn)定性實驗對牛源性DNA含量為10%、1%、0.5%及0.1%的陽性模擬樣品,每個樣品重復20次LAMP擴增,通過實時熒光檢測法評價本文所建立的LAMP的方法穩(wěn)定性。

1.2.8適用性實驗為了驗證本文所建立的LAMP方法的實際檢測能力,對市售的12種牛肉及牛肉制品中的牛源性成分進行鑒定,通過實時熒光檢測法評價本文所建立的LAMP的方法適用性。同時采用國標[4]中的熒光PCR方法和商品化的TAKARA牛源性成分檢測試劑盒進行鑒定,與本文所建立的LAMP方法進行結果比對。

2　結果與分析

2.1牛源性成分LAMP檢測方法的確立與優(yōu)化

實時熒光監(jiān)測結果顯示,在25 μL的反應體系中,當dNTPs濃度為1.6 mmol/L,Mg2+濃度為6 mmol/L,甜菜堿濃度為1 mol/L,反應溫度為63℃,反應時間為45 min時,LAMP反應的擴增效果最好,黃牛、水牛和牦牛的DNA模板均能得到明顯擴增。

2.2特異性實驗

利用建立的LAMP方法對31種動物的總DNA進行特異性擴增。實時熒光法的結果見圖1,可知只有澳洲黃牛、科爾沁黃牛、水牛和牦牛出現(xiàn)特異性擴增,在其他動物的模板中均未得到任何擴增產物,表明本文所建立的檢測牛源性成分的LAMP方法具有高度的方法特異性。

圖1　牛源性成分LAMP檢測方法特異性實驗結果Fig.1　Specificity evaluations on LAMP reaction system for bovine ingredient detection注:黃牛1為澳洲黃牛,黃牛2為科爾沁黃牛,其余27種動物DNA模板分別為狗肉、蝦肉、貉肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、番鴨肉、水鴨肉、鵪鶉肉、鷓鴣肉、乳鴿肉、雞肉、羅非魚、蟹肉、牡蠣、鵝、鱷魚肉、田雞肉、石蛙、昆明小鼠、SD大鼠、家兔、新西蘭白化兔、驢肉、單峰駱駝、馬肉、綿羊(檢科院)。

2.3靈敏度實驗

本文所建立的LAMP方法對黃牛、水牛和牦牛DNA模板的檢測靈敏度結果見圖2。實時熒光的檢測結果表明本文所建立的LAMP方法對黃牛、水牛和牦牛的最低檢測限均可達0.1%,具有極高的方法靈敏度。

圖2　牛源性成分LAMP檢測方法靈敏度實驗結果Fig.2　Sensitivity evaluations on LAMP reaction system for bovine ingredient detection

2.4穩(wěn)定性實驗

穩(wěn)定性實驗結果顯示梯度濃度的黃牛、水牛和牦牛DNA模板在20次重復實驗中均能得到準確而又穩(wěn)定的有效擴增,假陰性率和假陽性率均為0,表明本文所建立的檢測牛源性成分的LAMP方法具有良好的穩(wěn)定性和重復性。圖3是以黃牛為例的牛源性成分LAMP檢測方法的穩(wěn)定性實驗結果。

圖3　以黃牛牛肉為例的牛源性成分LAMP檢測方法的穩(wěn)定性實驗結果。Fig.3　Stability evaluations on LAMP reaction system for bovine ingredient detection(cattle)

2.5適用性實驗

本文所建立的檢測牛源性成分的LAMP方法適用性實驗結果見圖4。實時熒光的檢測結果表明該檢測方法對市售的牛肉及其牛肉制品中牛源性成分的鑒定與國標方法(圖5)及商品化檢測試劑盒(圖6)完全一致,假陽性率和假陰性率均為0,表明本文建立的牛源性成分LAMP檢測方法適用于生鮮牛肉及經過調味、風干制作的牛肉制品中牛源性成分的檢測。

圖4　牛源性成分LAMP檢測方法適用性實驗結果Fig.4　Applicability evaluations on LAMP reaction system for bovine ingredient detection

圖5　牛源性成分國標檢測方法適用性實驗結果Fig.5　Applicability evaluations on national standard method for bovine ingredient detection

圖6　牛源性成分商品化試劑盒適用性實驗結果Fig.6　Applicability evaluations on commercial detection kits for bovine ingredient detection

3　結論

本文建立了肉及肉制品中牛源性成分的LAMP檢測方法,該方法適用于生鮮牛肉及經過調味、風干制作的牛肉制品中牛源性成分的特異性檢測,對我國南方主要食用牛肉-水牛、北方地區(qū)主要食用牛肉-黃牛及高原地區(qū)牛肉源牦牛均具有較高特異性,靈敏度均高達0.1%,以及良好的穩(wěn)定性和重復性,是一種較為理想的快速定性檢測方法,可滿足基層實驗室日常檢驗和進出口現(xiàn)場檢驗的條件與需求,具有極大的推廣意義。

本文建立的LAMP檢測方法選用線粒體細胞色素B基因為靶基因是在其具有高度保守性的基礎上,綜合考慮食品加工中的腌制、烹飪等過程對肉及肉制品中DNA的影響,選擇拷貝數(shù)較多,在食品加工過程中降解程度相對較低的線粒體細胞色素B基因為目標基因[11]。

表3　實際樣品檢測結果

僅僅依靠視覺、嗅覺、觸覺與味覺等感官評價及經驗來鑒別肉及肉制品的摻假行為已遠遠不能滿足現(xiàn)實檢測要求。隨著分子生物學的持續(xù)發(fā)展和現(xiàn)代儀器分析手段的不斷完善,對肉及肉制品中動物源性成分的鑒別技術逐漸形成了基于蛋白質和基于核酸的兩大檢測技術體系,檢測靈敏度與準確度均大幅提高[12]。蛋白質在肉及肉制品中分布差異較大,在腌制、烹飪等過程中易變性受損等因素限制了其在熟肉及肉制品中的應用,因此不適用于肉及肉制品中的牛源性成分檢測[13-14];在熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性方面略勝一籌的DNA作為遺傳信息的載體具有特異性高,不受組織類別限制等優(yōu)點,逐步成為肉及肉制品種屬鑒別的技術主流,在此基礎上衍生出PCR-RFLP[15]、RAPD-PCR[16]、實時熒光PCR[17]和LAMP[7]等技術。實時熒光定量PCR方法目前是肉類種屬鑒別的主流,本文用來比對的國標方法和商品化檢測試劑盒均是實時熒光PCR方法。LAMP則是肉及肉制品種屬鑒別技術中極具潛力的發(fā)展方向，自2010年Ahmed等人[18]首開先河把LAMP與電化學傳感器結合進行肉類種屬來源的鑒別以后，LAMP在肉及肉制品種屬鑒別領域得到越來越多的認可與重視；2012年侯東軍[19]等人以細胞色素B基因組為模板,建立了LAMP檢測方法運用于牛肉和羊肉中雞肉、鯉魚肉和豬肉成分的摻雜鑒定;2014年德國研究者還建立了以鴕鳥源性cytB基因的LAMP檢測方法[20],韓國研究者甚至還針對豬、牛、雞、鴨、馬、山羊、綿羊和火雞8種動物的線粒體DNA分別設計了種特異性引物以構建LAMP的肉源性鑒定[21]。本研究正是在這種發(fā)展趨勢下深入研究LAMP技術在牛源性成分檢測中的應用，并進一步細化肉源。從適用性實驗結果看,3種方法均能定性檢測出肉及肉制品中的牛源性成分,但從實時熒光監(jiān)測圖可知,本文建立的LAMP檢測方法擴增效率最高,檢測也更為靈敏。此外,本文建立的LAMP檢測方法對儀器設備的要求相對較低,只需恒溫加熱,即可采用終點顯色法進行結果判讀,在基層及現(xiàn)場檢驗中具有很大應用前景,這是本文建立此檢測方法的初衷,在此基礎上建立肉及肉制品中牛源性成分的LAMP定量檢測方法則是本文下一步研究計劃。

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Development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP)method for rapid detection of bovine in meat and meat products

XIAN Yu-yin1,2,YI Min-ying1,2,ZHANG Huang3,GAO Dong-wei1,2,LING Li1,2,*

(1.Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center,Guangzhou 510623,China; 2.Guangdong Key Laboratory of Import and Export Technical Measures of Animal,Plant and Food,Guangzhou 510623,China; 3.Guangzhou Diao Bio-Technonly Co.Ltd.,Guangzhou 510663,China)

According to the sequence of bovine mitochondrial cytochrome B(cytB)gene,sets of bovine-specific loop-mediated isothermal amplification(LAMP)primers were designed and screened with the Primer Explorer Version 4 software.Optimization of the parameters and the reaction system was made to establish the rapid detection LAMP method for bovine ingredient in meat and meat products.The specificity,sensitivity and stability of this method was evaluated and compared to national standard method and commercial detection kit.The bovine ingredient detection in 12 meat and meat products were 100% consistent to the sample information,indicated that this method with high specificity,sensitivity and stability could be used to detect bovine ingredient in fresh or processed meat products.

loop-mediated isothermal amplification;detection;meat and meat products;bovine ingredient

2015-10-14

冼鈺茵(1990-),女,碩士,食品科學,從事微生物檢測,E-mail:1037206309@qq.com。

凌莉(1978-),女,碩士,從事微生物檢測,E-mail:joiceling@163.com。

廣東局科技項目(2014GDK08);廣州市科技計劃項目(2014Y2-00081)。

TS251.5

A

1002-0306(2016)07-0278-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.045