響應(yīng)面分析法優(yōu)化超臨界CO2萃取藍(lán)莓花色苷工藝條件的研究

田密霞,李亞?wèn)|,胡文忠,王艷穎,姜愛(ài)麗,劉程惠

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118;2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600)

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響應(yīng)面分析法優(yōu)化超臨界CO2萃取藍(lán)莓花色苷工藝條件的研究

田密霞1,2,李亞?wèn)|1,*,胡文忠2,王艷穎2,姜愛(ài)麗2,劉程惠2

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118;2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600)

以藍(lán)莓為原料,利用響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取藍(lán)莓花色苷的工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間和液料比為影響因素,應(yīng)用Box-Behnken方法進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn),以花色苷含量為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析。確定萃取的最佳工藝條件是萃取時(shí)間60 min,萃取溫度40 ℃,萃取壓力28 MPa,液料比為7∶1(mL∶g),花色苷含量的預(yù)測(cè)值為1.59 mg/g,驗(yàn)證值為1.58 mg/g。結(jié)果表明利用響應(yīng)面分析方法對(duì)超臨界CO2萃取藍(lán)莓花色苷的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù),從而為進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

藍(lán)莓,花色苷,超臨界二氧化碳萃取,響應(yīng)面法

藍(lán)莓是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生落葉或常綠灌木漿果類果樹(shù),因其果實(shí)中含有獨(dú)特的功效物質(zhì),以及含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)、超氧化物歧化酶等,被國(guó)際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[1-2]。藍(lán)莓中最重要的物質(zhì)就是花色苷,許多研究表明,藍(lán)莓花色苷有良好的保健功能,對(duì)于癌癥[3-5]、肝臟損傷[6-7]、高血壓[8]、糖尿病[9-10]、動(dòng)脈硬化[11-13]、記憶力減退[14-15]、視網(wǎng)膜剝離[10]、骨質(zhì)疏松[16-17]等疾病,均有較好療效。

花青素性質(zhì)很不穩(wěn)定,為提取及保存帶來(lái)了一定的困難。目前主要提取方法為溶劑法[18-21],超聲波提取法[22-23]和酶解提取法[24],國(guó)內(nèi)外尚未有超臨界CO2流體萃取法萃取藍(lán)莓花色苷的報(bào)道。此法可避免萃取物在高溫下分解,保護(hù)生理活性物質(zhì)的活性及保護(hù)萃取物的天然風(fēng)味。本文采用Box-Behnken響應(yīng)面曲線設(shè)計(jì)法對(duì)超臨界CO2萃取關(guān)鍵影響因素進(jìn)行優(yōu)化,建立超臨界CO2萃取藍(lán)莓花色苷的數(shù)學(xué)模型,為藍(lán)莓的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)開(kāi)辟新的途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

采摘自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)果園內(nèi)新鮮、成熟度一致、無(wú)病蟲(chóng)害的藍(lán)莓果實(shí),冷凍保藏溫度在-40 ℃冰柜中備用。無(wú)水乙醇、正己烷、鹽酸(均為分析純)國(guó)藥集團(tuán)。

Labda-250型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)PE;電子天平上海梅特勒-托利多;pHS-25 型酸度計(jì)上海偉業(yè)儀器廠;202-2A型電熱恒溫干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水多用真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;PC/PLC箱式冷凍干燥儀(MILLROCK TECHNOLOGY);7071型超臨界CO2流體萃取儀美國(guó)ASI公司;11B S25型食品粉碎機(jī)IKA;LC20AB液相色譜儀日本島津。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1超臨界CO2萃取藍(lán)莓花色苷工藝流程藍(lán)莓凍果打漿→(稱取一定質(zhì)量的藍(lán)莓凍果,充分打漿)→冷凍干燥(藍(lán)莓漿冷凍干燥,干燥后的粉末過(guò)80目篩,得到實(shí)驗(yàn)用的藍(lán)莓粉)→樣品裝釜(準(zhǔn)確稱取2 g藍(lán)莓粉,加80%乙醇,密閉)→超臨界萃取(控制合適的溫度、壓力等實(shí)驗(yàn)條件在超臨界狀態(tài)下萃取)→分離(萃取完成后,由分離釜獲得花色苷)[25]

1.2.2總花色苷含量的測(cè)定色譜柱:Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm,2.5μm),流動(dòng)相:50% A:0.5%冰乙酸,50%;B:100%甲醇,流速0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm,檢測(cè)時(shí)間30 min。方法參照文獻(xiàn)[26]。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)在固定分離溫度為35 ℃,分離壓力為5 MPa,CO2流量為20 kg/h,夾帶劑乙醇濃度為80%的基礎(chǔ)上,選擇萃取壓力(24～34 MPa)、萃取時(shí)間(20～120 min)、液料比[4∶1～8∶1(mL∶g)]和萃取溫度(25～50 ℃)4個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以考察各關(guān)鍵因素對(duì)藍(lán)莓花色苷含量的影響,每次取冷凍干燥后藍(lán)莓樣品2 g,確定較優(yōu)萃取范圍。

1.2.3.1萃取壓力的影響稱取2 g藍(lán)莓粉,在萃取時(shí)間60 min、萃取溫度40 ℃、液料比7∶1(mL∶g)的條件下,分別在24、26、28、30、32和34 MPa下萃取,然后按照1.2.2測(cè)花色苷含量。

1.2.3.2萃取時(shí)間的影響稱取2 g藍(lán)莓粉,在萃取溫度40 ℃、萃取壓力為30 MPa、液料比7∶1(mL∶g)的條件下,分別在20、40、60、80、100和120 min下萃取,然后按照1.2.2測(cè)花色苷含量。

1.2.3.3萃取液料比的影響稱取2 g藍(lán)莓粉,在萃取時(shí)間60 min、萃取溫度40 ℃、萃取壓力為30 MPa的條件下,液料比分別為4∶1、5∶1、6∶1、7∶1和8∶1(mL∶g)下萃取,然后按照1.2.2測(cè)花色苷含量。

1.2.3.4萃取溫度的影響稱取2 g藍(lán)莓粉,在萃取時(shí)間60 min、萃取壓力為30 MPa、液料比7∶1(mL∶g)的條件下,分別在25、30、35、40、45和50 ℃下萃取,然后按照1.2.2測(cè)花色苷含量。

1.2.4響應(yīng)面曲線法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以上述4個(gè)關(guān)鍵因素為自變量,以花色苷含量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[27]。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1萃取壓力的影響由圖1可知,花色苷含量隨壓力的增加先增加后下降。萃取釜中穩(wěn)定的高壓可以破壞物料的細(xì)胞結(jié)構(gòu),提高滲透效果,使浸提更加充分,因此適當(dāng)?shù)膲毫梢蕴岣呋ㄉ蘸?但當(dāng)壓力過(guò)大時(shí),可能會(huì)破壞花色苷的結(jié)構(gòu)使其降解[28]。所以在中心組合實(shí)驗(yàn)中選擇26、28、30 MPa作為三個(gè)水平參數(shù)。

表1　響應(yīng)面分析因素與水平

圖1　不同萃取壓力對(duì)萃取效果的影響Fig.1　Effect of extraction pressure on blueberry anthocyanins content

2.1.2萃取時(shí)間的影響由圖2可知,花色苷含量隨著提取時(shí)間的增加,呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),當(dāng)時(shí)間為60 min時(shí),吸光值達(dá)到最大值。這說(shuō)明時(shí)間對(duì)花色苷的提取有顯著的影響,時(shí)間過(guò)短,提取不充分,時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)導(dǎo)致花色苷的降解,而且時(shí)間長(zhǎng)的話實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。從節(jié)約能源的角度出發(fā),中心組合實(shí)驗(yàn)中選擇20、40、60 min作為提取的三個(gè)水平參數(shù)。

圖2　不同萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.2　Effect of extraction time on blueberry anthocyanins content

2.1.3液料比的影響由圖3可知,吸光值隨著料液比的增加而增加,當(dāng)液料比為7∶1(mL∶g)時(shí),吸光值達(dá)到最大。當(dāng)液料比大于7∶1(mL∶g)時(shí),物料太稀,萃取過(guò)程中會(huì)從萃取釜中泄露,而且裝料困難。從實(shí)際操作和成本來(lái)考慮,料液比在7∶1(mL∶g)為宜。所以在中心組合實(shí)驗(yàn)中選擇6∶1、7∶1和8∶1(mL∶g)為三個(gè)水平參數(shù)。

圖3　不同液料比對(duì)萃取效果的影響Fig.3　Effect of extraction liquid materials ratio on blueberry anthocyanins content

2.1.4萃取溫度的影響由圖4可知,隨溫度的增加,吸光值先增加后下降,原因可能是隨著溫度的升高加劇了分子間的熱運(yùn)動(dòng),花色苷擴(kuò)散到溶劑中的速度加快。但高溫會(huì)降低CO2流體的密度,使其溶解度降低,而且高溫可能會(huì)影響花色苷的結(jié)構(gòu)和活性,使之降解[28],所以從實(shí)際情況出發(fā),在中心組合實(shí)驗(yàn)中選擇35、40、45 ℃作為提取的三個(gè)水平參數(shù)。

圖4　不同萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.4　Effects of extraction temperature on blueberry anthocyanins content

2.2響應(yīng)面曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert軟件,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,得到響應(yīng)面方程為:

花色苷含量=1.57-0.028A+0.031B-0.012C+0.014D-0.032AB+0.011AC-3.750×10-3AD-0.046BC+0.037BD-0.046CD-0.085A2-0.041B2-0.066C2-0.082D2

從表3可以看出,模型的p<0.0001,說(shuō)明該回歸模型極顯著,擬合性好,用該模型來(lái)分析各因素對(duì)花色苷含量的影響是有意義的。A,B,C,D,AB,BC,BD,CD,A2,B2,C2,D2各項(xiàng)p值均小于0.001說(shuō)明極為顯著,AD的p值大于0.05,為不顯著。失擬項(xiàng)反映的是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符情況,p=0.5310>0.05,說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著,未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很小。因此,該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面。此外,校正系數(shù)Adj R-Squared2=0.9898,自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系好,說(shuō)明方程可靠性較高。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明該回歸方程擬合程度較好,可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)藍(lán)莓花色苷最佳提取工藝條件。

每個(gè)響應(yīng)面對(duì)其中兩個(gè)因素進(jìn)行分析,另外兩個(gè)因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響,從實(shí)驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可以找到它們?cè)谔崛∵^(guò)程中的相互作用[22]。

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由圖5可以看出萃取時(shí)間對(duì)花色苷吸光值的影響最為顯著,其次是萃取溫度和萃取壓力,其表現(xiàn)為曲線相對(duì)較陡,影響最小的是液料比,表現(xiàn)為曲線較為平滑。萃取壓力和萃取溫度之間交互作用不顯著,萃取壓力和液料比之間、萃取壓力和萃取時(shí)間、萃取時(shí)間和液料比、萃取時(shí)間和萃取溫度、液料比和萃取溫度之間交互作用較顯著。

表3　回歸方程方差分析表

圖5　兩因素交互作用對(duì)藍(lán)莓花色苷的交互影響Fig.5　Response surface plot showing the interactive effects of two factors on blueberry anthocyanins content

注:***為極顯著(p<0.001),**為非常顯著(p<0.01),*為顯著(p<0.05)。

2.3最佳條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀?jì)算出的最優(yōu)參數(shù)為:萃取時(shí)間60 min,萃取溫度40.01 ℃,萃取壓力28 MPa,液料比為7∶1(mL∶g)。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面分析結(jié)果與實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況是否一致,根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在萃取時(shí)間60 min,萃取溫度40 ℃,萃取壓力28 MPa,液料比為7∶1(mL∶g)的條件下萃取藍(lán)莓花色苷,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),得到藍(lán)莓花色苷含量約為1.58 mg/g,這與理論預(yù)測(cè)值1.59 mg/g相近,而且重復(fù)性好,說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3　結(jié)論

利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的藍(lán)莓花色苷萃取工藝的最佳條件為萃取時(shí)間60 min,萃取溫度40 ℃,萃取壓力28 MPa,液料比為7∶1(mL∶g)。此最佳條件下的花色苷含量理論值1.59 mg/g,實(shí)際測(cè)得值為1.58 mg/g,優(yōu)化得到的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合較好。

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Optimization of supercritical CO2extraction of Blueberry Anthocyanins using response surface methodology

TIAN Mi-xia1,2,LI Ya-dong1,*,HU Wen-zhong2,WANG Yan-ying2,JIANG Ai-li2,LIU Cheng-hui2

(1.Horticultural College,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2. College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)

The present study aimed to optimize supercritical carbon dioxide extraction of anthocyanins from blueberry using response surface methodology based on a 4-variable,3-level Box-Benhnken design. The results showed that the optimum conditions were extraction pressure of 28 MPa,extraction temperature of 40 ℃,extraction time of 60 min and liquid materials ratio of 7∶1(mL∶g). Under these conditions,the model predicted and experimental values of anthocyanins content were 1.59 mg/g and 1.58 mg/g,respectively.

Blueberry;Anthocyanins;Supercritical CO2extraction;response surface methodology

2015-05-15

田密霞(1979Q)，女，博士研究生，工程師，研究方向：果蔬保鮮加工及其功能性成分研究， E-mail：tmx@dlnu.edu.cn。

李亞?wèn)|(1964-)，男，碩士，教授，研究方向：小漿果種質(zhì)資源及栽培生理，E-mail:bluberryli@163.com。

農(nóng)業(yè)部2011公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)小漿果產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與試驗(yàn)示范(201103037)；大果藍(lán)莓與抗寒唐棣新品種選育及配套栽培技術(shù)研究, 吉林省財(cái)政廳項(xiàng)目(2012004)；藍(lán)莓優(yōu)質(zhì)高效組培微繁育苗技術(shù)推廣，吉林省科技廳發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20110828)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000