黑蒜加工過程中內(nèi)生細菌的分離鑒定及其增效作用的研究

姬妍茹,石杰,王月明,2,劉宇峰,*,董艷,楊慶麗,張正海,3,劉玉

(1.黑龍江省科學(xué)院大慶分院,黑龍江大慶 163319;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

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黑蒜加工過程中內(nèi)生細菌的分離鑒定及其增效作用的研究

姬妍茹1,石杰1,王月明1,2,劉宇峰1,*,董艷1,楊慶麗1,張正海1,3,劉玉1

(1.黑龍江省科學(xué)院大慶分院,黑龍江大慶 163319;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

本文對黑蒜加工不同時期樣品中的內(nèi)生細菌進行分離鑒定,從中分離出1株芽孢桿菌,通過形態(tài)特征觀察及16S rDNA序列測定對其進行鑒定,結(jié)果表明該菌為枯草芽孢桿菌,在大蒜汁培養(yǎng)基中生長時,具有生長旺盛、耐熱性強、產(chǎn)黑色素的特點。將其回接到生蒜瓣上,50 ℃條件下48 h蒜瓣變?yōu)楹谏?而未接種的蒜瓣則變?yōu)榈S色,說明該菌液對大蒜由白蒜變?yōu)楹谒庥幸欢ǖ呢暙I。這為研究黑蒜的形成機理提供了數(shù)據(jù)佐證,為進一步開發(fā)黑蒜發(fā)酵菌劑奠定了實驗基礎(chǔ)。

大蒜,內(nèi)生細菌,黑蒜,枯草芽孢桿菌,促進發(fā)酵

植物內(nèi)生細菌是指能在活體植物內(nèi)定殖,不引起寄主植物組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,在正常情況下,不引起寄主植物出現(xiàn)病害癥狀的細菌[1]。內(nèi)生細菌在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間,不易受環(huán)境條件的影響,與寄主植物之間是一種和諧的共生關(guān)系[2]。內(nèi)生菌可以產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物,這些產(chǎn)物具有多種生物活性,這些功能使得內(nèi)生菌作為一種植物益生菌在生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌劑等多個領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

大蒜是一種調(diào)味香辛類蔬菜[3],具有抗菌消炎、提高機體免疫力、預(yù)防和治療心血管疾病、防治腫瘤等多方面的功能[4]。黑蒜是由新鮮的帶皮生蒜在高溫高濕的環(huán)境下,不添加任何添加劑自然發(fā)酵而成,是大蒜的深加工產(chǎn)品。與生大蒜相比,黑蒜沒有了刺激性的蒜臭味,口感酸甜,而且粗蛋白和多酚等營養(yǎng)功效成分含量有一定的提高[5],深受消費者的喜愛。常規(guī)的黑蒜加工工藝生產(chǎn)周期較長,成本較高,價格居高不下,制約了黑蒜食品的發(fā)展。近幾年,科研人員針對黑蒜工藝優(yōu)化和改進方面開展了很多研究,羅倉學(xué)[6]等通過對發(fā)酵工藝中溫度、時間等影響因素的實驗分析,以黑蒜產(chǎn)品的感官評價及可溶性糖含量等為指標研究了溫度對黑蒜發(fā)酵的影響,確定了液態(tài)黑蒜發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。安東[7]對大蒜在不同溫度條件下的總酚、5-羥甲基糠醛(5-HMF)、可溶性糖等含量的變化進行了研究,確定了黑蒜的有效熟化時間范圍。

有關(guān)黑蒜工藝優(yōu)化方面的相關(guān)文獻較多,但是還沒有涉及到將大蒜內(nèi)生菌作為發(fā)酵菌劑應(yīng)用到黑蒜加工過程中的報道,本實驗從黑蒜加工不同時期的樣本中進行大蒜內(nèi)生菌的分離和鑒定,并將其回接到生蒜汁、熟蒜汁和生蒜瓣上進行實驗,以期獲得能夠促進黑蒜發(fā)酵的益生菌,研制出黑蒜發(fā)酵促進劑,為黑蒜加工工藝的優(yōu)化提供一條新的解決途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大蒜為白皮分瓣蒜,黑龍江省阿城市;黑蒜以所購大蒜為原料利用單位自主研制的發(fā)酵設(shè)備加工獲得。

細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒;DNA Marker 564bp/21226bp、柱式DNA膠回收試劑盒:上海生工生物公司;其他試劑均采用國產(chǎn)分析純。

BSC-1360ⅡA2生物安全柜北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;DYY-5電泳儀北京六一儀器廠;FR980凝膠像系統(tǒng)上海復(fù)日科技儀器有限公司;PCR儀;BK-5000電子顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司;LDZX-40SCI高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療儀器廠;HPX-9082MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2大蒜內(nèi)生菌的分離和純化

取適量黑蒜加工各階段的樣品,75%乙醇處理蒜瓣5 min,3%次氯酸鈉處理10 min,再用75%乙醇處理1 min,最后用無菌水洗滌3次,用無菌的研缽磨碎后稱量25 g,加入225 mL無菌水中充分搖勻,吸取1 mL注入9 mL無菌水中,梯度稀釋到10-4、10-5,吸取1 mL,傾倒入上述三種培養(yǎng)基中,每個處理3次重復(fù)。PDA馬鈴薯培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,PCA細菌培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱和厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28～72 h,適時檢查菌落形態(tài)和生長情況,選擇形態(tài)、大小和顏色等特征不同的菌落進行劃線分離純化,得到純化菌株后,接斜面置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3菌株的活力比較

將耐高溫的菌株接種到生蒜汁和熟蒜汁培養(yǎng)基上,培養(yǎng)48 h之后進行活菌數(shù)測定,選取活力最強的菌株作為促進黑蒜發(fā)酵的入選菌株。

1.4菌株的形態(tài)鑒定及分子鑒定

將篩選到的菌株梯度稀釋后,在PDA培養(yǎng)基上涂布,獲得單菌落。進行革蘭氏染色初步確定菌株的特性并進行顯微觀察。

16S rDNA基因的PCR引物 上游引物 F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3),下游引物R(5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3)。PCR擴增反應(yīng)體系:0.25 μL Taq DNA聚合酶,5 μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液,4 μL dNTP,1 μL Primer F(上游引物),1 μL Primer R(下游引物),1 μL模板DNA,ddH2O補足50 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃變性3 min后進入循環(huán);94 ℃變性45 s;55 ℃退火45 s,72 ℃ 延伸90 s,30個循環(huán)后72 ℃終延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行基因測序。

1.5回復(fù)性發(fā)酵實驗

稱量生大蒜600 g加入600 mL無菌水置于無菌料理機中打成勻漿液,定容到1200 mL,制成生蒜汁,均分成4份,每份3個平行,裝入500 mL三角瓶中;將生蒜在80～100 ℃水中煮15 min,其他步驟同生蒜汁制法;大蒜去皮后用無菌水清洗蒜瓣,置于250 mL燒杯中,備用。

將入選的2株優(yōu)良大蒜內(nèi)生菌用PDA液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后,按1∶1比例混合,以3%接種量接種于生蒜汁、熟蒜汁和生蒜瓣中,扎好瓶口。生蒜汁和熟蒜汁瓶置于42 ℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后,調(diào)到50 ℃培養(yǎng)48 h。觀察發(fā)酵液的顏色、氣味、狀態(tài)的變化情況,測定各樣品的活菌數(shù),生蒜瓣于接種7 d后觀察顏色變化情況。

2　結(jié)果與分析

2.1促進黑蒜發(fā)酵菌株的篩選

在加工0、1.8、2.8、4.5、6.2、24、48、72、96、120、144、168、240、288、312、336、360、384 h時間點分別取出蒜瓣樣品S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17,進行表面滅菌后,采用平板稀釋法進行分離,得到60株內(nèi)生細菌。這60株菌均分離自S0至S8樣品,在S8之后的樣品中沒有檢測到活菌的菌落存在,說明在黑蒜加工過程中樣品表面及內(nèi)部的細菌經(jīng)過持續(xù)反復(fù)的高溫處理之后基本失去活力,同時也說明從S8樣品中篩選到的菌株具有一定的耐高溫能力,因此最終選擇加工96 h的S8樣品中分離到的5株內(nèi)生細菌作為促進黑蒜發(fā)酵的實驗菌株。將這5株菌在生蒜汁和熟蒜汁培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),結(jié)果見表1。

從表1可知,對兩代種子發(fā)酵液而言,前3株菌幾乎都產(chǎn)堿性物質(zhì),發(fā)酵液的顏色變化不大,氣味欠佳,活菌數(shù)的數(shù)量級為109,而S8nyzx-1和S8nzm-1可以使蒜汁的顏色變?yōu)榉奂t色,產(chǎn)生令人比較愉悅的酒味,而且活菌數(shù)都在1010以上,顯著高于前3株菌(p<0.01),發(fā)酵液pH略微偏酸,比較符合黑蒜酸甜口感的要求,適合作為黑蒜發(fā)酵促進劑的入選菌株。二者相比,S8nyzx-1的菌活力更高一些,是S8nzm-1的3倍,因此選擇前者送至上海生工進行16s rDNA測序鑒定。

表1　黑蒜發(fā)酵菌兩代種子液的培養(yǎng)情況

注:**p<0.01。

2.2促進黑蒜發(fā)酵的大蒜內(nèi)生菌的菌落特征及分子鑒定

2.2.1大蒜內(nèi)生菌的菌落特征S8nyzx-1菌株在有氧條件下菌落為白色圓形菌落,表面有皺褶(圖1)。革蘭氏染色陽性,有芽孢,長桿菌(圖2),在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)黑色素。在厭氧條件下也可生長,只是生長速度略慢。

圖1　S8nyzx-1菌落圖片F(xiàn)ig.1　S8nyzx-1 Colony morphology

圖2　S8nyzx-1顯微圖片F(xiàn)ig.2　S8nyzx-1 Microscopy morphology

2.2.2大蒜內(nèi)生菌的16S rDNA鑒定經(jīng)上海生工鑒定,促進黑蒜發(fā)酵的大蒜內(nèi)生菌的S8nyzx-1的16S rDNA序列長度為1419 bp(圖3),輸入Genebank進行同源性序列比較,與其同源性較高的序列均屬于Bacillus subtilis subsp. subtilis 菌屬,同源性在99.8%的菌株有8株,基本可以確定S8nyzx-1菌株為枯草芽孢桿菌的亞種。

表2　S8nyzx-1菌株16S rDNA序列Blast結(jié)果

圖3　16S rDNA擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3　Eletrophoresis of amplification products of 16S Rdna注:M為Mark的條帶圖;1和2均為菌株S8nyzx-1的條帶圖。

2.3大蒜發(fā)酵菌劑的回復(fù)性發(fā)酵實驗結(jié)果

圖4　幾種菌液對不同狀態(tài)培養(yǎng)基的發(fā)酵情況比較Fig.4　Fermentation case of Several bacilli in different mediaa.生蒜瓣發(fā)酵空白對照；b. S8nzm-1生蒜瓣發(fā)酵；c. S8nyzx-1菌生蒜瓣發(fā)酵；d.混合菌生蒜瓣發(fā)酵；e.生蒜汁空白發(fā)酵液；f.熟蒜汁空白發(fā)酵液；g. S8nyzx-1菌生蒜汁發(fā)酵液；h. S8nyzx-1菌熟蒜汁發(fā)酵液；i. S8nzm-1菌生蒜汁發(fā)酵液；j.S8nzm-1熟蒜汁發(fā)酵液；k.混合菌生蒜汁發(fā)酵液；l.混合菌熟蒜汁發(fā)酵液。

從表3和圖4可知,與空白對照相比,接種培養(yǎng)48 h后,2株參試菌對生蒜汁和熟蒜汁在顏色上沒有區(qū)別;在口感上處理組及熟蒜汁空白對照均為淡甜味,沒有蒜辣味,只是生蒜汁空白對照未產(chǎn)生甜味,仍有蒜辣味;在狀態(tài)上處理組均為粘度降低、液化趨勢,而空白對照雖然也有液化趨勢,但是粘度沒有變化。與其他1株參試內(nèi)生菌相比,S8nyzx-1菌株對生蒜汁、熟蒜汁和生蒜瓣的發(fā)酵效果在感官上基本相似,但是就活菌數(shù)而言,在生蒜汁中是另1株菌的6倍,在熟蒜汁中是另1株菌的近20倍。

在對生蒜瓣發(fā)酵實驗中,接種48 h后,2株菌分別單獨處理時只是使蒜變?yōu)楹趾谏?混合菌在50 ℃條件下發(fā)酵7 d蒜瓣可全部變成黑色(圖3)。無論是單菌還是混合菌都只是使蒜瓣具有淡甜味,必須經(jīng)過93 ℃高溫處理15 h后才能達到黑蒜成品的真正甜味和軟度。而空白對照在口感上無甜味、有辣味,經(jīng)過93 ℃高溫處理15 h后也未變甜,雖然在狀態(tài)上變軟,但只是變?yōu)辄S褐色,并沒有變?yōu)楹谏?注:此處數(shù)據(jù)來源于表3)。

表3　不同黑蒜發(fā)酵菌株的回復(fù)性發(fā)酵實驗結(jié)果

注:*p<0.05,**p<0.01。

3　討論

本實驗以黑蒜加工過程中不同時期的蒜瓣為樣本進行了大蒜內(nèi)生菌的分離研究,結(jié)果獲得了60株內(nèi)生菌,經(jīng)過耐高溫及在色澤和口感等方面表現(xiàn)的篩選獲得2株對黑蒜發(fā)酵有促進作用的細菌,其中以S8nyzx-1菌株表現(xiàn)最佳,經(jīng)上海生工鑒定,該菌株的16s rDNA序列長度為1419 bp,與Bacillus subtilis subsp. subtilis的同源性為99.8%,基本可以確定S8nyzx-1菌株為枯草芽孢桿菌。將S8nyzx-1等2株菌進行黑蒜發(fā)酵回接實驗,可使大蒜瓣在較低的溫度下(50 ℃)經(jīng)48 h變成黑色,比原有工藝的96 h縮短了一半的時間。本實驗篩選得到的菌株S8nyzx-1和S8nzm-1來自于大蒜蒜瓣自身,而且貫穿于黑蒜的自發(fā)酵過程,是大蒜的自有內(nèi)生菌種,其生物安全性值得信賴,可以將其作為黑蒜生產(chǎn)發(fā)酵促進劑進行研究和使用。

本實驗所分離獲得的內(nèi)生菌菌株均來自于黑蒜加工的最初96 h之內(nèi),這說明齒變式加熱生產(chǎn)黑蒜的工藝[8]對內(nèi)生菌的生長有一定的幫助,反復(fù)的升溫和降溫過程使得具有一定耐高溫能力的內(nèi)生菌得以存活生長,也正是這些細菌的生長對大蒜的變黑起到了積極的促進作用。同時經(jīng)過持續(xù)的反復(fù)升降溫處理之后大蒜表面及內(nèi)部的細菌基本失活,保證了黑蒜的食品安全性。

實驗還發(fā)現(xiàn)將S8nyzx-1菌單獨或者與其他菌株混合接種到生蒜瓣上在較低的溫度下(50 ℃)雖然可以加速蒜瓣變黑,但是卻無法獲得成品黑蒜所具有的甜味,只有在經(jīng)過高溫(93 ℃)處理15 h之后才具有成品黑蒜的甜味。這說明S8nyzx-1菌株在生長繁殖過程中,只具有產(chǎn)黑色素的功能,不具有使多糖等物質(zhì)分解為單糖的能力。

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Separation and identification of endophytic bacteria strains and its increase effect in the production process of black garlic

JI Yan-ru1,SHI Jie1,WANG Yue-ming1,2,LIU Yu-feng1,*,DONG Yan1，YANG Qing-li1，ZHANG Zheng-hai1,3，LIU Yu1

(1.Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences,Daqing 163319,China;2.College of Food Science,Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China;3.College of Life Science Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)

One endophytic bacillus bacteria from different time of Garlic cloves production was isolated and identified. The strain was identified by morphological characteristics and 16S-rDNA sequence alignment. It was Bacillus subtilis with the characteristics of vigorous growth,melanin production and high temperature resistance. At 50 ℃,the raw garlic cloves which inoculated with the bacteria turned black after 48 h,those not inoculated became yellowish only. The strain has some help to the process of raw garlic changing into black garlic. The results can provide supporting data for the research of black garlic formation mechanism,and made the contribution to further development of black garlic fermented bacteria agent.

endophytic bacteria;black garlic;Bacillus subtilis;fermentation promotion

2015-04-09

姬妍茹(1971-),女,碩士,副研究員,研究方向:食品微生物及生物技術(shù),E-mail:jyr309@sohu.com。

劉宇峰(1963-),女,學(xué)士,研究員級高工,研究方向:功能食品及益生菌研究,E-mail:lyf5558@yahoo.com.cn。

大慶市科學(xué)技術(shù)局創(chuàng)新能力建設(shè)項目(SCX2010-07);省財政基本科研業(yè)務(wù)費專項項目(cz10G01)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000