乙酸異戊酯高產(chǎn)菌株脂肪酶Lip2基因的克隆及表達(dá)研究

譚才鄧,朱美娟,廖延智,朱曉立

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510300)

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乙酸異戊酯高產(chǎn)菌株脂肪酶Lip2基因的克隆及表達(dá)研究

譚才鄧,朱美娟,廖延智,朱曉立*

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510300)

通過PCR擴(kuò)增了乙酸異戊酯高產(chǎn)菌Loq-c的脂肪酶基因Lip2,其序列與Gene Bank中的Candida cylindracea Lip2 gene(序列號(hào)X64704.1)的序列相似度最高,為89%。構(gòu)建原核表達(dá)載體pQE-lip2,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3),獲得了重組菌BL21(pQE-lip2)。經(jīng)過表達(dá)條件探索,用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,脂肪酶Lip2原核可溶表達(dá)最佳條件為:誘導(dǎo)溫度30 ℃,IPTG使用濃度為1.5 mmol/L,150 r/min轉(zhuǎn)速的條件下誘導(dǎo)表達(dá)5 h。

乙酸異戊酯,脂肪酶,克隆,表達(dá)

酯類化合物是發(fā)酵食品的重要香氣成分之一,酵母菌是在發(fā)酵食品中合成酯類物質(zhì)的重要微生物。酵母菌合成酯類化合物的途徑主要有三個(gè):酯化反應(yīng)、醇解反應(yīng)和脫氫反應(yīng)[1]。酯化反應(yīng)是合成酯類化合物的主要途徑,其催化反應(yīng)的酶類為脂肪酶,因此脂肪酶被廣泛應(yīng)用于食品加工及食品風(fēng)味改良。此外脂肪酶在油脂工業(yè)、洗滌工業(yè)、化妝品工業(yè)及生物能源等方面應(yīng)用廣泛[1-5]。近年來,在醫(yī)藥工業(yè)中,脂肪酶因能被用于手性制備光學(xué)純的藥物而倍加矚目[3]。

脂肪酶(EC 3.1.1.3)有多個(gè)同工酶,Longhi[6]等研究發(fā)現(xiàn)柱狀假絲酵母(Candidacylindracea)有5個(gè)脂肪酶同工酶;Fickers[7]等研究解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)時(shí),發(fā)現(xiàn)菌株E150能編碼合成16個(gè)脂肪酶同工酶,而分泌到胞外的脂肪酶主要是Lip2,并且Lip2偏好催化合成短鏈酯類。

菌株Loq-c是本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的一株高產(chǎn)乙酸異戊酯的克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)。本實(shí)驗(yàn)參考前人的結(jié)果設(shè)計(jì)多個(gè)脂肪酶引物,通過PCR反應(yīng)試探菌株Loq-c是否有脂肪酶,是否通過脂肪酶合成乙酸異戊酯,并將其克隆及進(jìn)行原核表達(dá)研究,為生物高效合成乙酸異戊酯提供有價(jià)值的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1質(zhì)粒與菌種質(zhì)粒為pQE30;乙酸異戊酯生產(chǎn)菌Loq-c,克隆菌株E.coliDH5α,表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)。以上材料均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2試劑藥品Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購于上海生工生物工程公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase購于寶生物工程(大連)有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純藥品。

1.1.3儀器SHP-150生化培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;ZWY-240搖床上海智誠分析儀器制造有限公司;SC-3614高容量低速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器公司;1-14高速離心機(jī)Sigma;EasyCycler96PCR儀德國耶拿分析儀器股份公司;電泳儀Mini-PROTEAN、Mini-Sub cell GT,BIO-RAD;電穿孔儀MicroPulser,BIO-RAD;XO-150超聲細(xì)胞波破碎儀南京先歐儀器制造公司。

1.1.4引物

表1　脂肪酶PCR擴(kuò)增引物

注:引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株Loq-c粗酶的制備將50 mL菌株Loq-c發(fā)酵液經(jīng)3000 r/min離心5 min,菌體沉淀用5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)懸浮,于研缽中添加適量石英砂研磨破碎5 min,3000 r/min離心5 min,上清液即為粗酶液,置于4 ℃冰箱中保存,12 h內(nèi)使用。

1.2.2菌株Loq-c粗酶中酯類合成酶的定性分析酵母菌合成酯類化合物關(guān)鍵酶主要有3類,分別為脂肪酶(R1COOH+R2OH →R1COOR2+H2O)、醇?；D(zhuǎn)移酶(R1OH+R2COSCoA →R2COOR1+CoASH)和醇脫氫酶(R1OCH(OH)R2+NAD(P)+→R2COOR1+NADH+H+),其中脂肪酶是主要的酯類合成酶[1,3]。根據(jù)其底物的不同,本實(shí)驗(yàn)對菌株Loq-c粗酶中是否含有脂肪酶進(jìn)行定性實(shí)驗(yàn),將10 mL菌株Loq-c粗酶液置于50 mL三角瓶中,加入0.1 mL乙酸,0.1 mL異戊醇,用封口膜封口,于搖床中30 ℃、120 r/min振蕩反應(yīng)2 h(同時(shí)做對照實(shí)驗(yàn)),由于產(chǎn)物乙酸異戊酯的氣味(香蕉味)特殊,其濃度在1 μL/L時(shí)可明顯辨別,因此通過氣味感官評定判斷是否產(chǎn)生乙酸異戊酯。

1.2.3酵母基因組NDA提取根據(jù)Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒操作說明書進(jìn)行,總DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?用于PCR反應(yīng)擴(kuò)增脂肪酶基因片段。

1.2.4PCR擴(kuò)增初步確定脂肪酶同工酶種類PCR反應(yīng)體系:5×PrimeSTAR 緩沖液10 μL,dNTP混合液(每種2.5 mmol/L)5 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA模板1 μL,PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL,補(bǔ)水至50 μL。

PCR反應(yīng)程序:96 ℃預(yù)變性4 min;96 ℃變性20 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸2 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增情況。

1.2.5脂肪酶Lip2基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同1.2.4,引物重新設(shè)計(jì):上游引物(cgcggatccatgaagctctgtttgcttgctcttggtgct,酶切位點(diǎn)為Bam HI),下游引物(cccaagctttactacacaaa gaacagtggcgggttggaa,酶切位點(diǎn)為Hind Ⅲ)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,用內(nèi)切酶Bam HI與Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切,同時(shí)對質(zhì)粒pQE30進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后,用T4連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

1.2.6脂肪酶Lip2基因序列比對分析與原核表達(dá)分析挑取陽性轉(zhuǎn)化菌株,搖菌提取重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測序,所得序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對分析。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)后,從誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)物IPTG濃度等條件對脂肪酶Lip2進(jìn)行原核表達(dá)分析。

1.2.7誘導(dǎo)時(shí)間對脂肪酶Lip2可溶表達(dá)的影響分析在誘導(dǎo)溫度30 ℃,IPTG濃度1 mmol/L,轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下,誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間設(shè)定在0～24 h,同時(shí)以含空載體pQE30的表達(dá)菌株進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。離心取等量的菌體分別進(jìn)行超聲波破碎,經(jīng)13000 r/min離心10 min后取上清液,進(jìn)行SDS-PAGE分析表達(dá)情況。

1.2.8誘導(dǎo)溫度對脂肪酶Lip2可溶表達(dá)的影響分析在最佳誘導(dǎo)時(shí)間,IPTG濃度1 mmol/L,轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下,誘導(dǎo)表達(dá)溫度分別設(shè)定在24～40 ℃之間。同1.2.7,用SDS-PAGE方法進(jìn)行表達(dá)情況分析。

1.2.9誘導(dǎo)物IPTG濃度對脂肪酶Lip2可溶表達(dá)的影響分析在最佳誘導(dǎo)時(shí)間,在最佳誘導(dǎo)溫度,轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下,誘導(dǎo)物IPTG使用濃度設(shè)定在0.2～4.0 mmol/L之間。同1.2.7,用SDS-PAGE方法進(jìn)行表達(dá)情況分析。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株Loq-c粗酶中酯類合成酶的定性分析

通過定性實(shí)驗(yàn)及感官評定:含有粗酶液與底物的反應(yīng)瓶中明顯聞到乙酸異戊酯的味道,而只有粗酶液或只有底物的對照瓶中沒有聞到乙酸異戊酯的味道,因此可判斷菌株Loq-c中催化合成乙酸異戊酯的酶類中有脂肪酶。

2.2菌株Loq-c脂肪酶同工酶種類的初步分析

根據(jù)Longhi[6]等的研究結(jié)果,分別設(shè)計(jì)5個(gè)脂肪酶同工酶引物,以Loq-c基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增脂肪酶基因片段,PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1。

圖1　菌株Loq-c脂肪酶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis analysis of Lipase PCR products of strain Loq-c注:M-marker DS2000;泳道1～5:引物分別為Lip1、Lip2、Lip3、Lip4、Lip5的PCR產(chǎn)物。

從圖1可知,Lip2引物對擴(kuò)增出條帶,在1.0～2.0 kbp有明顯條帶,與目標(biāo)片段1.6 kbp吻合,而其它引物對則沒有擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶,可認(rèn)為菌株Loq-c催化合成乙酸異戊酯的酶類有脂肪酶Lip2。

2.3脂肪酶Lip2基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)表達(dá)載體pQE30的多克隆位點(diǎn)重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增Lip2基因片段,PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pQE30分別進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化克隆菌株DH5α,重組質(zhì)粒命名為pQE-lip2。重組質(zhì)粒經(jīng)測序,所得序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對分析,結(jié)果顯示,其序列與Gene Bank中的CandidacylindraceaLip2 gene(序列號(hào)X64704.1)的序列相似度最高,為89%,表明菌株Loq-c脂肪酶Lip2基因克隆成功。將重組質(zhì)粒pQE-lip2轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)中,對其表達(dá)進(jìn)行分析研究。

2.4Loq-c脂肪酶Lip2原核可溶表達(dá)分析

為了探討脂肪酶Lip2在大腸桿菌中能否以可溶的形式進(jìn)行表達(dá),從誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)物IPTG濃度這幾方面進(jìn)行單因素探索,結(jié)果如下:

2.4.1誘導(dǎo)時(shí)間對脂肪酶Lip2可溶表達(dá)的影響誘導(dǎo)時(shí)間對重組蛋白可溶表達(dá)的影響結(jié)果見圖2。

圖2　誘導(dǎo)時(shí)間對脂肪酶Lip2可溶表達(dá)的影響Fig.2　Effect of induced time on soluble expression of Lipase 2注:1:pQE30;2:0 h;3:1 h;4:2 h;5:3 h;6:5 h;7:10 h;8:15 h;9:24 h。

由圖2可知,含空載體pQE30的表達(dá)菌株經(jīng)過24 h的誘導(dǎo),并沒表達(dá)出目的蛋白(泳道1)。重組質(zhì)粒pQE-lip2在0～24 h的表達(dá)情況如下:0 h時(shí)沒表達(dá)出目的蛋白(泳道2),從1 h開始,上清液中在44～66 ku之間有明顯條帶,與目標(biāo)片段58 ku吻合(箭頭處),進(jìn)一步表明Liq2基因克隆成功,并且脂肪酶Lip2在大腸桿菌中能以可溶形式進(jìn)行表達(dá)。從圖中可看出,脂肪酶Lip2在第5 h(泳道6)時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值,往后延長表達(dá)時(shí)間并沒有再提高目的蛋白表達(dá)量,因此可認(rèn)為脂肪酶Lip2可溶表達(dá)最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。

2.4.2誘導(dǎo)溫度對脂肪酶Lip2可溶表達(dá)的影響誘導(dǎo)溫度對重組蛋白可溶表達(dá)的影響結(jié)果見圖3。

圖3　誘導(dǎo)溫度對脂肪酶Lip2可溶表達(dá)的影響Fig.3　Effect of induced temperature on soluble expression of Lipase 2注:1:24 ℃;2:26 ℃;3:28 ℃;4:30 ℃;5:32 ℃;6:34 ℃;7:36 ℃;8:38 ℃;9:40 ℃。

由圖3可知,誘導(dǎo)表達(dá)溫度在30 ℃時(shí),目的蛋白條帶最濃(泳道4),說明在此溫度Lip2可溶表達(dá)量最高。當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)細(xì)胞生命活動(dòng)速率較慢,目的蛋白表達(dá)量較低;當(dāng)溫度高于32 ℃時(shí),目的蛋白可能轉(zhuǎn)向以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá),導(dǎo)致可溶表達(dá)量不再提高。因此可認(rèn)為Lip2可溶表達(dá)最佳誘導(dǎo)溫度為30 ℃。

2.4.3誘導(dǎo)物IPTG使用濃度對脂肪酶Lip2可溶表達(dá)的影響誘導(dǎo)物IPTG使用濃度對重組蛋白可溶表達(dá)的影響結(jié)果見圖4。

圖4　誘導(dǎo)物IPTG使用濃度對脂肪酶Lip2可溶表達(dá)的影響Fig.4　Effect of concentration of IPTG on soluble expression of Lipase 2注:1:0.2 mmol/L;2:0.5 mmol/L;3:1.0 mmol/L;4:1.5 mmol/L;5:2.0 mmol/L;6:2.5 mmol/L;7:3.0 mmol/L;8:3.5 mmol/L;9:4.0 mmol/L。

由圖4可知,當(dāng)IPTG濃度在1.5 mmol/L以內(nèi)時(shí),Lip2可溶表達(dá)量隨著IPTG濃度的提高而升高,并在1.5 mmol/L時(shí)達(dá)到最高,繼續(xù)提高IPTG濃度并沒能提高Lip2的可溶表達(dá)量,可能較高濃度IPTG的作用下Lip2轉(zhuǎn)向包涵體形式進(jìn)行表達(dá)。因此可認(rèn)為Lip2可溶表達(dá)最佳IPTG使用濃度為1.5 mmol/L。

3　結(jié)論與展望

本實(shí)驗(yàn)成功克隆獲得乙酸異戊酯高產(chǎn)菌株Loq-c的脂肪酶Lip2基因,其序列與Gene Bank中的Candida cylindracea Lip2 gene(序列號(hào)X64704.1)的序列相似度最高,為89%。構(gòu)建原核表達(dá)載體pQE-lip2并進(jìn)行原核可溶表達(dá)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:脂肪酶Lip2在大腸桿菌中能以可溶形式進(jìn)行表達(dá),其可溶表達(dá)的最佳條件為:誘導(dǎo)溫度30 ℃,IPTG使用濃度為1.5 mmol/L,150 r/min轉(zhuǎn)速的條件下誘導(dǎo)表達(dá)5 h。

目前,對目的酶基因進(jìn)行異源高效表達(dá)是獲得高活力酶的一種最直接、高效、便捷的方式,當(dāng)然,由于糖基化、蛋白質(zhì)折疊等翻譯后修飾的不同,會(huì)導(dǎo)致一些異源表達(dá)的蛋白不具備其本身具有的活性,因此可溶活性表達(dá)非常重要。目前異源表達(dá)系統(tǒng)大致可分為原核表達(dá)與真核表達(dá),原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)相比,有其自身的優(yōu)點(diǎn):譬如培養(yǎng)條件簡單,成本低,后繼純化工作簡單等,因此本實(shí)驗(yàn)以原核表達(dá)的方式進(jìn)行外源表達(dá)脂肪酶Lip2基因。本研究的后續(xù)工作應(yīng)在脂肪酶Lip2的分離純化與活性研究方面展開,為生物高效合成乙酸異戊酯提供有價(jià)值的參考。

[1]莊世文,付俊淑,黃金海. 酵母菌合成酯類化合物關(guān)鍵酶基因的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(2):433-436.

[2]解復(fù)紅,權(quán)淑靜,馬煥,等. 解脂耶氏酵母脂肪酶基因Lip2在畢赤酵母中高活力表達(dá)[J]. 河南科學(xué),2013,31(5):589-593.

[3]黃璜,李宗軍,王遠(yuǎn)亮,等. 各類微生物脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 糧油食品科技,2014,22(1):109-118.

[4]王建榮,劉丹妮,李鵬,等. 克氏擔(dān)孢酵母脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J]. 食品科學(xué),2015,36(3):104-108.

[5]肖瀟. 皺褶假絲酵母脂肪酶LIP1在畢赤酵母中的高效表達(dá)與高密度發(fā)酵研究[D]. 武漢:華中科技大學(xué),2013.

[6]Longhi S,Fusetti F,Grandori R,et al. Cloning and nucleotide sequences of two lipase genes fromCandidacylindracea[J]. Biochimica et Biophysica Acta,1992,1131(2):227-232.

[7]Fickers P,Marty A,Nicaud JM. The lipases fromYarrowialipolytica:Genetics,production,regulation,biochemical characterization and biotechnological applications[J]. Biotechnology Advances,2011,29(6):632-644.

Study on the cloning and prokaryotic soluble expression of Lipase geneLip2 of high-yield isoamyl acetate strain

TAN Cai-deng,ZHU Mei-juan,LIAO Yan-zhi,ZHU Xiao-li*

(Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300,China)

The gene encoding Lipase2(Lip2)from high-yield isoamyl acetate strain Loq-c was amplified by polymerase chain reaction(PCR),its sequence was most similar to Candida cylindracea Lip2 gene(X64704.1),the similarity was 89%. Subsequently,the corresponding expression vector pQE-lip2 was constructed and cloned intoE.coliBL21(DE3),resulting in recombinant strain BL21(pQE-lip2). After explorations,SDS-PAGE analysis showed that the best conditions for soluble expression of Lip2 was:30 ℃,IPTG 1.5 mmol/L,150 r/min,induced for 5 hours.

Isoamyl acetate;Lipase;clone;express

2015-05-19

譚才鄧(1980-)，男，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品與生物技術(shù)，E-mail：tcdeng@126.com。

朱曉立(1980-)，男，碩士，副教授，研究方向：食品與生物技術(shù)，E-mail：zxl800101@126.com。

廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(Yq2013166)；廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ201308)；廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院創(chuàng)新強(qiáng)校重大科研項(xiàng)目培養(yǎng)計(jì)劃(1A20205)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000