引入疏水性氨基酸對(duì)GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

李同彪,周晨妍,*,朱新術(shù),王丹丹,2

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

?

引入疏水性氨基酸對(duì)GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

李同彪1,周晨妍1,*,朱新術(shù)1,王丹丹1,2

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

木聚糖酶,熱穩(wěn)定性,α-螺旋,疏水性,定點(diǎn)突變

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一種可以內(nèi)切β-1,4糖苷鍵的糖苷類水解酶[1]。基于木聚糖酶與底物作用方式、初級(jí)結(jié)構(gòu)以及疏水性的不同,木聚糖酶主要分為GH11和F10家族[2]。相比F10家族,GH11家族的木聚糖酶具有底物特異性,可以催化含有D-木糖的底物[3],GH11家族木聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)呈右手半握狀,主要由一個(gè)α-螺旋和兩個(gè)β-折疊片層組成,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單[4]。木聚糖酶在飼料加工、烘烤、造紙、制藥、釀造以及生物燃料等多個(gè)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力[5]。目前,大多數(shù)木聚糖酶屬于中溫木聚糖酶,阻礙了工業(yè)應(yīng)用的進(jìn)程。在工業(yè)應(yīng)用中,耐熱木聚糖酶可以提高生產(chǎn)效率、降低能源消耗以及污染率[6]。因此,提高木聚糖酶熱穩(wěn)性已成為研究者廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。目前,通過(guò)生物信息學(xué)分析比對(duì)木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),提高氫鍵和離子鍵數(shù)目[7]、N端的延伸、分子內(nèi)部引入二硫鍵[8]、增強(qiáng)分子內(nèi)部以及α-螺旋處的疏水作用[9]等可以提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)為木聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究提供了理論依據(jù)。

目前,對(duì)于增強(qiáng)分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部疏水作用以提高GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究相對(duì)較少,但已取得了顯著的成果。如Taeho Kim等[10]利用網(wǎng)絡(luò)分析來(lái)源于Bacilluscirculans木聚糖酶分子內(nèi)的疏水作用,通過(guò)定點(diǎn)突變(W58F、G64A、K95L、H156V、M158L和V168I)整合k-clique更高的疏水作用集群,穩(wěn)定木聚糖酶的局部結(jié)構(gòu)以提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性,并發(fā)現(xiàn)該酶的半衰期提高了78倍,解鏈溫度提高了8.8 ℃。由此可見(jiàn),良好的疏水性氨基酸集群構(gòu)象對(duì)木聚糖酶的熱穩(wěn)定性也起著至關(guān)重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)室前期已從黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S中分離出木聚糖酶基因xynZF-2,并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌BL21中異源表達(dá)的基礎(chǔ)上[11],本文利用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)等手段,從分析酶的構(gòu)效關(guān)系為切入點(diǎn),引入疏水性氨基酸,增強(qiáng)疏水作用,以期提高木聚糖酶XynZF-2的熱穩(wěn)定性,為該酶后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

表達(dá)質(zhì)粒pET-28a、EscherichiacoliJM109、BL21(DE3)均購(gòu)自Novagen公司,重組質(zhì)粒pET-28a-xynZF-2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存;DNA質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒購(gòu)自Sangon公司;限制性內(nèi)切酶、DL1000 DNA Marker、TA克隆載體pMDTM18-T、IPTG、X-gal及T4DNA Ligase購(gòu)自TaKaRa公司;其他試劑主要來(lái)源于是進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

梯度PCR擴(kuò)增儀C1000 Bio-Rad Laboratory;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-2)北京市六一儀器廠;DC-0506低溫恒溫槽上海比朗儀器有限公司;HZQ-F160A恒溫振蕩器上海一恒科學(xué)儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 23R)上海力申科學(xué)有限公司。

1.2活性中心預(yù)測(cè)及同源序列建模

木聚糖酶XynZF-2催化活性中心預(yù)測(cè)在http://prosite.expasy.org網(wǎng)站上完成[12]。在http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index網(wǎng)站上完成對(duì)XynZF-2、XynED以及XynMA的同源序列比對(duì)及建模。

1.3定點(diǎn)突變

依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)上下游引物(見(jiàn)表1)。采用重疊延伸PCR法[13]以及兩步PCR法[14]進(jìn)行目的基因定點(diǎn)突變。以重組質(zhì)粒pET-28a-xynZF-2為模板,分別擴(kuò)增突變基因xynED(含有E103D、E194D突變位點(diǎn))以及xynMA(含有V125A、K178M以及G180A突變位點(diǎn))。TA克隆,構(gòu)建重組載體pMDTM18-T-xynED以及pMDTM18-T-xynMA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,經(jīng)藍(lán)白斑篩選,送金唯智公司測(cè)序。

表1　突變引物名稱及序列

注:陰影堿基表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),下劃線堿基為突變位點(diǎn)。

1.4重組木聚糖酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建

轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)測(cè)序正確后,提取重組質(zhì)粒pMDTM18-T-xynED及pMDTM18-T-xynMA,以此為模板,PCR擴(kuò)增突變基因xynED和xynMA。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切突變基因xynED和xynMA,1.0%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物并割膠回收,分別與質(zhì)粒pET-28a連接,構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-xynED以及pET-28a-xynMA,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),經(jīng)Kan抗性篩選出陽(yáng)性單克隆菌落。

1.5重組木聚糖酶基因誘導(dǎo)表達(dá)

將重組菌分別過(guò)夜培養(yǎng),以1/50的接種量分別接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至A600為0.6時(shí),加入終濃度為2 mmol/L的IPTG,誘導(dǎo)2 h,培養(yǎng)條件為37 ℃、230 r/min,離心菌體,加入檸檬酸-磷酸氫二鈉(pH 4.6)緩沖液,超聲波破碎離心得到上清粗酶液。

1.6重組木聚糖酶純化

采用5 mL鎳金屬螯合層析柱對(duì)含有His標(biāo)簽蛋白的重組木聚糖酶XynZF-2和XynMA進(jìn)行純化,并采用15%分離膠和5%濃縮膠,SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)純化后的重組蛋白XynZF-2和XynMA,具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

1.7重組木聚糖酶活性測(cè)定

采用DNS法測(cè)定木聚糖酶活性[11]。1.5 mL 0.5%樺木木聚糖溶液加入1 mL酶液,在40 ℃條件下反應(yīng)15 min,加入DNS立即終止反應(yīng),沸水浴7 min顯色,冷卻后加入5 mL蒸餾水,測(cè)定A540。在以上條件下,以每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)單位(U)。

1.8重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

在35～60 ℃水浴條件下,每隔5 ℃,反應(yīng)15 min,按1.7方法測(cè)定重組木聚糖酶酶活性。以最高酶活性為100%計(jì)算各個(gè)溫度下重組木聚糖酶的相對(duì)酶活性,作出溫度-相對(duì)酶活性曲線。將酶液在40 ℃和45 ℃條件下,保溫0～60 min,每隔5 min取樣,測(cè)定殘余酶活性,以未保溫的酶液酶活性為100%,數(shù)據(jù)具體處理方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

2　結(jié)果與分析

2.1同源序列比對(duì)建模及突變位點(diǎn)確定

同源建模發(fā)現(xiàn),木聚糖酶XynZF-2由一個(gè)簡(jiǎn)單的α-螺旋以及兩個(gè)反向的β-折疊片層組成,呈右手半握狀結(jié)構(gòu),屬于GH11家族(圖1)。通過(guò)木聚糖酶XynZF-2活性中心預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),第103、194位點(diǎn)的谷氨酸位于底物與酶相互作用的中心位點(diǎn)。為證實(shí)催化活性中心預(yù)測(cè)的正確性,根據(jù)氨基酸相似性以及大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性,將第103、194位點(diǎn)的谷氨酸分別替換成天冬氨酸。利用DS ViewerPro6.0分析木聚糖酶XynZF-2疏水作用集群以及氨基酸序列發(fā)現(xiàn),在α-螺旋處出現(xiàn)疏水集群見(jiàn)圖1(藍(lán)色標(biāo)記為疏水性氨基酸殘基)并且遠(yuǎn)離活性中心位點(diǎn)。因此,定點(diǎn)突變?chǔ)?螺旋頂端位點(diǎn)(K178M、G180A)以及附近位點(diǎn)(V125A),增強(qiáng)疏水作用,期望提高該酶的熱穩(wěn)定性(圖2)。

圖1　木聚糖酶XynZF-2結(jié)構(gòu)Fig.1　The structure of the XynZF-2

圖2　雜合木聚糖酶結(jié)構(gòu)Fig.2　The structure of the hybrid xylanase

2.2定點(diǎn)突變

以重組質(zhì)粒pET-28a-xynZF-2為模板,PCR擴(kuò)增突變基因xynED和xynMA,TA克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,經(jīng)藍(lán)白斑篩選以及測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)與設(shè)計(jì)位點(diǎn)一致。

2.3木聚糖酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切突變基因xynED、xynMA和質(zhì)粒pET-28a連接,構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-xynED以及pET-28a-xynMA,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),經(jīng)Kan抗性篩選,用于后續(xù)表達(dá)。

2.4重組木聚糖酶的表達(dá)以及純化

2.4.1重組木聚糖酶XynED的誘導(dǎo)表達(dá)按1.5木聚糖酶誘導(dǎo)表達(dá)方法,誘導(dǎo)重組木聚糖酶XynED和XynZF-2,超聲波破碎提取粗酶液,按1.7酶活性測(cè)定方法測(cè)定XynED和XynZF-2酶活性,發(fā)現(xiàn)突變酶XynED酶活性為原酶XynZF-2的0.17%。SDS-PAGE蛋白電泳(圖3)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)的XynED和XynZF-2在25～35 ku處有明顯條帶,而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌BL21/pET-28a、未誘導(dǎo)的XynED和XynZF-2條帶相對(duì)較淺,說(shuō)明突變酶XynED在大腸桿菌BL21中得到很好的表達(dá)。由此推斷第103、194位點(diǎn)谷氨酸為木聚糖酶XynZF-2的活性中心關(guān)鍵氨基酸。

2.4.1重組木聚糖酶XynMA的表達(dá)和純化按1.5方法誘導(dǎo)表達(dá)重組木聚糖酶XynMA和XynZF-2,超聲波破碎提取粗酶液,并通過(guò)鎳金屬螯合親和層析柱對(duì)重組木聚糖酶XynMA和XynZF-2進(jìn)行純化,SDS-PAGE電泳檢測(cè)(圖4)。由圖4可見(jiàn),重組木聚糖酶XynMA和XynZF-2相對(duì)分子質(zhì)量一致,純化的蛋白樣品電泳后每條泳道僅有一條帶,說(shuō)明純度較高,達(dá)到了電泳純,基本滿足生物催化和酶學(xué)性質(zhì)分析。

圖4　重組木聚糖酶XynMA和XynZF-2 SDS-PAGE電泳Fig.4　SDS-PAGE analysis of the recombinant xylanase XynMA and XynZF-2注:M:蛋白質(zhì)Marker;1:純化后的木聚糖酶XynMA;2:純化后的木聚糖酶XynZF-2。

2.5重組木聚糖酶最適溫度及熱穩(wěn)定性的比較分析

圖5　重組木聚糖酶XynMA和XynZF-2最適溫度的比較Fig.5　Comparison of the optimum temperature between the recombinant xylanase XynMA and XynZF-2

圖6　重組木聚糖酶XynMA和XynZF-2熱穩(wěn)定性比較Fig.6　Comparison of the thermostability between the recombinant xylanase XynMA and XynZF-2

3　結(jié)論與討論

木聚糖酶作為一種重要的工業(yè)酶,廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域[15]。大多數(shù)應(yīng)用領(lǐng)域需要耐熱且具有高比活性的木聚糖酶。目前,主要由兩種途徑得到耐熱性木聚糖酶:一是對(duì)常溫高比活性酶進(jìn)行耐熱性分子改造,二是天然耐熱酶的篩選[16]。

[1]Zhang HM,Li JF,Wang JQ,et al.Determinants for the improved thermostability of a mesophilic family 11 xylanase predicted by computational methods[J].Biotechnology for Biofuels,2014,7(3):1-10.

[2]Tan ZB,Tang CD,Wu MC,et al.Exploration of disulfide bridge and N-glycosylation contributing to high thermostability of a hybrid xylanase[J].Protein and Peptide Letters,2014,21(9):657-662.

[3]Yin X,Yao Y,Wu MC,Zhu TD,et al.A unique disulfide bridge of the thermophilic xylanase SyXyn11 plays a key role in its thermostability[J].Biochemistry,2014,79(6): 675-683.

[4]Song LT,Dumon C,Siguier B,et al.Impact of an N-terminal extension on the stability and activity of the GH11 xylanase fromThermobacillusxylanilyticus[J].Journal of Biotechnology,2014,174:64-72.

[5]Qian CL,Liu N,Yan X,et al.Engineering a high-performance,metagenomic-derived novel xylanase with improved soluble protein yield and thermostability[J].Enzyme and Microbial Technology,2015,70:35-41.

[6]柏文琴,楊魯紅,馬延和.通過(guò)N端引入芳香族氨基酸提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性[J].生物工程學(xué)報(bào),2014,30(8):1217-1224.

[7]Li H,Voutilainen S,Ojamo H,et al.Stability and activity of dictyoglomus thermophilum GH11 xylanase and its disulphide mutant at high pressure and temperature[J].Enzyme and Microbial Technology,2015,70:66-71.

[8]Wang JQ,Tan ZB,Wu MC,et al.Improving the thermostability of a mesophilic family 10 xylanase,AuXyn10A,fromAspergillususamiiby in silico design[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2014,41(8):1217-1225.

[9]Yin X,Li JF,Wang JQ,et al.Enhanced thermostability of a mesophilicxylanase by N-terminal replacement designedby molecular dynamics simulation[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2013,93:3016-3023.

[11]You C,Huang Qi,Xue H,et al.Potential hydrophobic interaction between two cysteines in interior hydrophobic region improves thermostability of a family 11 xylanase fromNeocallimastixPatriciarum[J].Biotechnology and Bioengineering,2010,105(5):861-871.

[10]Kim T,Joo JC,Yoo YJ.Hydrophobic interaction network analysis for thermostabilization of a mesophilic xylanase[J]. Journal of Biotechnology,2012,161:49-59.

[11]付冠華,劉振華,王丹丹,等.黑曲霉木聚糖酶(xynZF-2)基因克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析[J].中國(guó)釀造,2012,31(11):78-82.

[12]Yin X,Gong YY,Wang JQ,et al.Cloning and expression of a family 10 xylanase gene(Aoxyn10)fromAspergillusoryzaeinPichiapastoris[J].Journal of General and Applied Microbiology,2013,59:405-415.

[13]付 正,張華山,曾小英,等.嗜熱真菌木聚糖酶1YNA的表達(dá)和定點(diǎn)突變[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(7):1488-1493.

[14]周晨妍,王 武,鄔敏辰.Arg引入“Ser/Thr”平面對(duì)木聚糖酶XynⅡ熱穩(wěn)定性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,38(1):46-51.

[15]Qian CL,Liu N,Yan X,et al.Engineering a high-performance,metagenomic-derived novel xylanase with improved soluble protein yield and thermostability[J].Enzyme and Microbial Technology,2015,70:35-41.

[16]高樹娟,汪俊卿,鄔敏辰,等.N端二硫鍵對(duì)11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2012,28(12):1441-1449.

Effect of introducing hydrophobic amino acids residues on the thermostability of family GH11 xylanases

LI Tong-biao1,ZHOU Chen-yan1,ZHU Xin-shu1，*,WANG Dan-dan1，2

(School of Life Science and Technology,Xinxiang Medical University,Xinxiang 45300,Henan Province,China)

xylanase;thermostability;α-helix domains;hydrophobicity;site-directed mutagenesis

2015-03-23

李同彪(1990-),男，碩士研究生，主要從事微生物酶工程研究,E-mail:tongbiaoli@163.com。

周晨妍(1979-)，女，博士，副教授，從事微生物酶工程研究，E-mail:zhouchenyan2008@163.com。

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A180861;14A180018)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(2011GGJS-125)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目培育基金(2013ZD113)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(YJSCX20434Y)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000