一株產(chǎn)藍色素放線菌的分離、鑒定及其色素穩(wěn)定性初步研究

牛世全,韓彩虹,胡蛟龍,李海云,耿　暉,閻薇如

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

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一株產(chǎn)藍色素放線菌的分離、鑒定及其色素穩(wěn)定性初步研究

牛世全,韓彩虹,胡蛟龍,李海云,耿暉,閻薇如

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

為了研究一株從鹽堿土中分離的產(chǎn)藍色素放線菌菌株DA04417的分類地位及其色素穩(wěn)定性。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析對該菌株進行鑒定,并對其色素穩(wěn)定性進行初步研究。結(jié)果表明菌株DA04417初步鑒定為灰紅鏈霉菌(Streptomyces griseoruber)。其產(chǎn)色素最大吸收峰為580 nm,色素在pH 3～11區(qū)域內(nèi)增色作用明顯;自然光和紫外光對色素都有一定的消色作用,但影響不大;色素在4～80 ℃內(nèi)穩(wěn)定;色素對還原劑Na2SO3穩(wěn)定,而氧化劑H2O2對色素有消色作用;色素對NaCl、蔗糖穩(wěn)定,檸檬酸鈉對色素有明顯消色作用;金屬離子對色素都有不同程度的消色作用。放線菌DA04417是一株具有開發(fā)前景和應(yīng)用潛力的產(chǎn)藍色素菌株。

藍色素,灰紅鏈霉菌,16S rRNA基因,色素穩(wěn)定性

天然色素主要來自于動、植物及微生物,具有安全可靠,色調(diào)自然等優(yōu)點。因此,天然色素的開發(fā)與應(yīng)用己成為各行業(yè)科技工作者普遍關(guān)注的課題[1-4]。到目前,色素研究主要集中于植物源色素,但從經(jīng)濟的角度來考慮,微生物應(yīng)是一種良好的天然色素源,今后必將引起更為廣泛的關(guān)注。

放線菌是一類具有重大實用價值的微生物資源,廣泛的存在于不同的自然生態(tài)環(huán)境之中。其代謝產(chǎn)物的應(yīng)用已涉及醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等多個領(lǐng)域。在已知的眾多源于微生物的活性物質(zhì)中,大約70%是由放線菌產(chǎn)生[5],在當前從常規(guī)放線菌尋找開發(fā)新化合物日益困難的情況下,不少學(xué)者已經(jīng)把目光投向?qū)O端環(huán)境放線菌的研究[6-9]。這類放線菌能長期生長在高溫、低溫、高酸、高堿或高鹽等極端特異環(huán)境中,具有獨特的基因類型、特殊的生理機制,從而產(chǎn)生特殊的代謝產(chǎn)物[10],這為開發(fā)利用極端環(huán)境條件下放線菌資源提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

本文從河西走廊酒泉地區(qū)鹽堿土壤中分離得到一株產(chǎn)藍色素的放線菌菌株DA04417,并對其進行形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析進行鑒定,并采用單因素實驗對其色素穩(wěn)定性進行初步研究,以期為天然色素的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

土壤樣品采集于2013年7月份,河西走廊酒泉地區(qū)荒郊的鹽堿土,采用五點取樣法采集土樣,即去除地表土,取0～20 cm的土壤樣品,每個點取樣量大體一致,土樣混勻后收集,采集土樣保存于滅菌的密封袋中,置于冰袋上冷藏迅速帶回實驗室,在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。DNA膠回收純化試劑盒北京全式金生物技術(shù)有限公司;Premix Ex Taq DNA聚合酶大連TaKaRa;高氏Ⅰ號培養(yǎng)基K2HPO40.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO40.01 g,KNO31 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,可溶性淀粉20 g,瓊脂 20 g,加水定容至1000 mL;Bennett培養(yǎng)基:葡萄糖 10 g,酵母浸粉1 g,牛肉膏1 g,干酪素2 g,水1000 mL。以上培養(yǎng)基均調(diào)pH8.5～9.0,倒板前加入75 μg/mL K2Cr2O7和2 μg/mL青霉素以抑制真菌及細菌。

PCR擴增儀美國Bio-Bad;凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Bad;H-1650R臺式高速冷凍離心機湘儀離心機儀器有限公司;電泳儀北京六一儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的分離純化稱取5 g土壤樣品于45 mL無菌水,振蕩混勻制備成10-3,10-4,10-5梯度的樣品菌懸液。取3個稀釋度樣品各200 μL,分別涂布于高氏Ⅰ號固體培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d,挑取產(chǎn)藍色素的菌株進行平板劃線法分離純化,直至得到純菌株后,轉(zhuǎn)到高氏Ⅰ號斜面培養(yǎng)基上,保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2菌株鑒定

1.2.2.1菌株形態(tài)及生理生化特征將純化后的菌株DA04417接種于高氏Ⅰ號培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)5 d,觀察菌株形態(tài)特征。并采用插片法[11],光學(xué)顯微鏡觀察其菌絲和孢子形態(tài)。參照《鏈霉菌鑒定手冊》中的方法觀察生理生化特性。

1.2.2.2分子學(xué)鑒定菌株DNA提取按照Zhou等[12]的方法,利用放線菌特異性引物[13]S-20/A-19進行16S rRNA基因擴增,PCR反應(yīng)條件參照Stach等[13]的方法。PCR擴增反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性45 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán),最后72 ℃總延伸5 min,PCR擴增產(chǎn)物送至華大基因公司測序。將所測序列輸入NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中,用BLAST程序與已知序列進行比較分析,利用MEGA5.0軟件的Neighbor-Joining方法進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.3菌株耐受性實驗

1.2.3.1耐鹽實驗配制pH 7.5的Bennett液體培養(yǎng)基,分成若干份,分別加入2.5%、5%、10%、15% NaCl,分裝到15×150 mm試管中,每管3 mL,121 ℃滅菌20 min。冷卻后接種待測菌株,重復(fù)3次,28 ℃振蕩培養(yǎng)7 d,記錄菌體生長狀況。

1.2.3.2耐堿實驗將Bennett液體培養(yǎng)基分別調(diào)整為pH8.0、9.0、10.0、11.0和12.0,其它步驟按照1.2.3.1進行。

1.2.4色素提取在1 L三角瓶中,裝取800 mL高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基進行滅菌,將供試菌株轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后,發(fā)酵液真空抽濾去除菌體,經(jīng)真空冷凍干燥得到粗提物,將色素粗提物稀釋10倍后,于200～700 nm波長范圍內(nèi)進行全波長光譜掃描,并記錄。

1.2.5pH對色素穩(wěn)定性的影響分別各取色素溶液5 mL,將pH調(diào)節(jié)為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0,重復(fù)3次,在波長580 nm處測定其吸光值。

1.2.6光照對色素穩(wěn)定性的影響分別各取色素溶液5 mL,置于自然光和紫外光下,在0、2、4、6 h取樣,重復(fù)3次,在波長580 nm處測定其吸光值。

1.2.7溫度對色素穩(wěn)定性的影響分別各取色素溶液5 mL,置于4、40、60、80和100 ℃的恒溫水浴中,分別在15、30、45和60 min時取樣,重復(fù)3次,在波長580 nm處測定其吸光值

1.2.8氧化劑、還原劑對色素穩(wěn)定性的影響分別各取色素溶液5 mL,加入氧化劑(10% H2O2)各1、2、3、4、5 mL;另取各取色素溶液5 mL,分別加入還原劑(10% Na2SO3)各1、2、3、4、5 mL,定容至10 mL,重復(fù)3次,2 h后在波長580 nm處測定其吸光值。

1.2.9食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響分別各取色素溶液5 mL,加入10% NaCl各1、2、3、4、5 mL,定容至10 mL;對于10%檸檬酸鈉、10%蔗糖同樣操作,重復(fù)3次,2 h后在波長580 nm處測定其吸光值。

1.2.10金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響分別各取色素溶液5 mL,加入0.1 mol/L Mg2+各1、2、3、4、5 mL,定容至10 mL;對于0.1 mol/L Ba2+、Ca2+、Mn2+、K+同樣操作,重復(fù)3次,8 h后于580 nm處測定吸光值。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理及制圖。

2　結(jié)果分析

2.1菌株鑒定

由圖1(A)可以看出,菌株DA04417在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上生長良好,蔨落圓形隆起,表面絮狀,氣生菌絲呈藍白色,基內(nèi)菌絲深藍色,產(chǎn)水溶性藍色素。在100倍油鏡下(見圖1(B)),該菌株孢子絲為長柄緊螺旋,具有典型的鏈霉菌屬的特征,因此將其歸類于鏈霉菌屬藍色類群。

通過對菌株DA04417生理生化特性進行鑒定,發(fā)現(xiàn)菌株DA04417能使淀粉和纖維素水解,能使明膠液化,并可以產(chǎn)生H2S,在NaCl濃度為2.5%～10%,pH 8～12能夠生長。

通過BLAST將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行比對,菌株DA04417與灰紅鏈霉菌(JF731255)的相似性為100%,并結(jié)合形態(tài)及生理生化特性鑒定結(jié)果,初步判定菌株DA04417為灰紅鏈霉菌(Streptomyces griseoruber),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

表1　菌株DA04417的生理生化特征及耐鹽堿實驗

圖2　基于16S rRNA基因序列同源性構(gòu)建的菌株DA04417的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　Phylogenetic tree of DA04417 constructed based on the sequences homology of 16S rRNA gene

圖1　菌株DA04417的菌落形態(tài)(A)及孢子絲(B)Fig.1　The colonial morphology(A)and conidium characteristics(B)of strain DA04417

注:+陽性反應(yīng),-陰性反應(yīng),*表示菌株生長強弱程度,0表示菌株沒有生長。

2.2色素穩(wěn)定性研究

2.2.1pH對色素穩(wěn)定性的影響如圖3所示,隨著pH的增加,色素的顏色逐漸加深,色素溶液的OD值也隨之增加,由此說明色素的穩(wěn)定性受pH的影響較大,并且堿性環(huán)境有利于該菌株的生長以及色素的產(chǎn)生。

圖3　pH對色素穩(wěn)定性的影響Fig.3　Effect of pH value on pigment

2.2.2光照對色素穩(wěn)定性的影響如圖4所示,自然光和紫外光對藍色素都有不同程度的消色作用。隨光照時間的增加,色素溶液OD值都有所變小,但自然光對色素穩(wěn)定性影響不太明顯,而紫外光對色素穩(wěn)定性的影響較大。

圖4　光照對色素的影響Fig.4　Effect of illumination on pigment

2.2.3溫度對色素穩(wěn)定性的影響如圖5所示,當溫度在4～80 ℃時,色素穩(wěn)定性較好;當溫度在100 ℃時,0～15 min內(nèi)色素吸光值稍有下降,之后趨于平穩(wěn)。

圖5　溫度對色素的影響Fig.5　Effect of temperature on pigment

2.2.4氧化劑、還原劑對色素穩(wěn)定性的影響如圖6所示,在色素溶液中加入1 mL氧化劑10% H2O2時,色素吸光值急劇下降,之后趨于平穩(wěn),表明氧化劑H2O2對色素有較強的消色作用。而隨著還原劑10% Na2SO3加入量的增加,色素吸光值略有下降,表明還原劑Na2SO3對色素穩(wěn)定性影響不大。

圖6　氧化劑、還原劑對色素的影響Fig.6　Effect of oxidizing and reducing agent on pigment

2.2.5食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響如圖7所示,當加入1 mL10%檸檬酸鈉后,色素吸光值急劇下降,當加入量繼續(xù)增大時,OD值趨于平穩(wěn),這表明檸檬酸鈉對該色素具有較強的消色作用。而NaCl與蔗糖隨著加入量的增加,色素OD值總體稍有下降,說明NaCl和蔗糖對該色素穩(wěn)定性影響不大。

圖7　食品添加劑對色素的影響Fig 7　Effect of food additive on pigment

2.2.6金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響如圖8所示,隨著色素溶液中金屬離子的加入,色素吸光值都呈現(xiàn)出下降趨勢,而隨著離子加入量的增高,色素吸光值趨于穩(wěn)定。表明各金屬離子對于色素的穩(wěn)定性都有不同程度的降低,其中以Ba2+的影響最大。

圖8　金屬離子對色素的影響Fig.8　Effect of metal irons on pigment

3　結(jié)論

從河西走廊酒泉地區(qū)鹽堿土壤中分離篩選出一株產(chǎn)藍色素的放線菌菌株DA04417,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析,初步將其鑒定為灰紅鏈霉菌(Streptomyces griseoruber)。通過對其色素穩(wěn)定性進行研究表明,隨著pH的升高色素增色作用增強;自然光和紫外光對色素都有一定的消色作用,但影響不大;溫度在低于80 ℃時,對色素的穩(wěn)定性影響不大;氧化劑H2O2對色素具有較強的消色作用,而還原劑Na2SO3對藍色素的穩(wěn)定性影響不大;NaCl、蔗糖對于色素的穩(wěn)定性無太大的影響,檸檬酸鈉對色素消色作用影響較大;金屬離子(Ba2+,Mn2+,Ca2+,K+,Mg2+)對色素的穩(wěn)定性都有不同程度的消色作用,其中以Ba2+影響最大。

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Preliminary study on the isolation,identification and pigment stability of a blue pigment producing actinomycete strain

NIU Shi-quan,HAN Cai-hong,HU Jiao-long,LI Hai-yun,GENG Hui,YAN Wei-ru

(College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China)

In order to study the taxonomic position and pigment stability of one blue-pigment producing actinomycete strain DA04417 which was isolated from the saline-alkali soil,the morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics,16S rRNA gene sequence of DA04417 were analyzed,and single factor test was detected the pigment stability. It showed that the strain DA04417 was preliminary identified as Streptomyces griseoruber. The maximum absorption peak of the pigment was at 580 nm,pigment showed color enhancement effect as pH3～11,and it was slightly weaken under natural light and ultraviolet light. As the temperature was 4～80 ℃,pigment was stabilized. The stability was not changed by reductant Na2SO3,but weakened by oxidant H2O2,not changed by NaCl and sucrose,but obviously weakened by sodium citrate. Metal ions had decolorization effect to pigment. Strain DA04417 has a application research potentiality of producing blue pigment.

Blue pigment;Streptomyces griseoruber;16S rRNA gene sequence;pigment stability

2015-04-27

牛世全(1963-),男,碩士,教授,研究方向:資源微生物,E-mail:sqniu@nwnu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項目(31260134,30960078)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000