金黃色葡萄球菌在豬肉上的生長以及新型腸毒素基因sek的表達(dá)

王　瓊,張　榮,陳　娟,龍　虎,唐俊妮

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

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金黃色葡萄球菌在豬肉上的生長以及新型腸毒素基因sek的表達(dá)

王瓊,張榮,陳娟,龍虎,唐俊妮*

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

目的:研究金黃色葡萄球菌在豬肉上的生長以及新型腸毒素sek的時(shí)序性表達(dá)。方法:將實(shí)驗(yàn)室保存的三株攜帶sek基因的金黃色葡萄球菌SA005、SA008和SAB0分別接種于無菌豬肉上37 ℃靜置培養(yǎng)至120 h,每隔12 h取樣進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)以及pH測定,同時(shí)收集不同時(shí)間點(diǎn)的菌體提取RNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測細(xì)菌生長過程中sek的相對表達(dá)量。結(jié)果:三株菌株在豬肉上生長36 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期,48 h肉上已經(jīng)出現(xiàn)肉眼可見的金黃色葡萄球菌菌體聚集,120 h肉粒變得粘稠并有黏液滲出;豬肉pH在細(xì)菌生長的36 h前變化不大,在120 h已逐漸上升到pH8.85～9.14;三株金黃色葡萄球菌sek的表達(dá)量在細(xì)菌生長的對數(shù)期有一次高表達(dá),隨后表達(dá)量下降,在生長的穩(wěn)定后期表達(dá)量再次升高,其中,SA005的sek基因在細(xì)菌的生長過程中表達(dá)量明顯高于SA008和SAB0(p<0.01)。結(jié)論:三株金黃色葡萄球菌在豬肉上生長,腸毒素sek基因持續(xù)表達(dá)但相對表達(dá)量因菌株而存在差異,sek基因在轉(zhuǎn)錄水平上的高表達(dá)將會(huì)帶來食品安全的潛在威脅。

金黃色葡萄球菌,豬肉,新型腸毒素sek,熒光實(shí)時(shí)定量PCR,時(shí)序性表達(dá)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是常見的食源性病原菌,由S.aureus引起的食源性疾病占所有食源性疾病爆發(fā)的7.4%,這一疾病的爆發(fā)主要源于S.aureus產(chǎn)生的腸毒素[1]。腸毒素是S.aureus分泌的一種具有超抗原特性的胞外蛋白,它能夠與抗原遞呈細(xì)胞(ACP)表面的組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)以及T細(xì)胞受體(TCR)的不同位點(diǎn)結(jié)合,刺激T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子釋放[1],誤食被S.aureus污染的食物會(huì)造成食物中毒。迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的S.aureus腸毒素血清型有23種,被分為傳統(tǒng)腸毒素SEA-SEE和新型腸毒素SEG-SElY[2-4],其中大部分腸毒素都存在一些不同變體,致使腸毒素種類具有多樣性。腸毒素SEK是Orwin等[5]2001年發(fā)現(xiàn)的一種新型腸毒素,分子量約為26 ku,等電點(diǎn)pI在7.0～7.5之間,對高溫和胃腸道內(nèi)的部分酶具有較強(qiáng)的耐受性,重組的SElK蛋白能夠刺激T細(xì)胞大量增殖[4],引起靈長目動(dòng)物嘔吐反應(yīng)[6]。編碼sek基因的移動(dòng)基因元件通常位于葡萄球菌基因島[7]和前噬菌體[8],這對于S.aureus適應(yīng)環(huán)境、物種間遺傳信息傳遞以及病原進(jìn)化至關(guān)重要[9]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腸毒素sek在臨床分離的S.aureus中較為流行[10-14],特別是在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株中的攜帶率明顯高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)[10,15-16],推測攜帶腸毒素sek基因的S.aureus引起的食物中毒可能比其它腸毒素更加難以治療。

另外,S.aureus腸毒素在食物基質(zhì)中的形成不同于實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)狀態(tài)下的形成[17]。豬肉作為高蛋白食品的典型代表,其營養(yǎng)成分、pH、鹽含量、水分活度,與細(xì)菌培養(yǎng)基成分存在較大差異[18]。目前,新型腸毒素在不同食物基質(zhì)中的表達(dá)情況可獲得的數(shù)據(jù)不多。因此,研究食物基質(zhì)中腸毒素的表達(dá)對于食品安全評估以及食物中毒預(yù)防具有借鑒意義。

本文擬采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),以ftsZ為內(nèi)標(biāo)基因[19-20],研究實(shí)驗(yàn)室保存的三株攜帶腸毒素sek基因的S.aureus菌株SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長不同時(shí)間點(diǎn)的sek基因相對表達(dá)量,進(jìn)一步了解腸毒素sek基因在豬肉中的表達(dá)規(guī)律,為攜帶sek基因的S.aureus引起食物中毒的風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實(shí)驗(yàn)室保存的三株攜帶腸毒素sek基因的S.aureus菌株SA005、SA008以及SAB0其中菌株SA005還攜帶耐甲氧西林基因mecA以及腸毒素seb、sec、sex基因,SA008含有mecA以及腸毒素sea和sex基因,SAB0還含有腸毒素sex基因,三株菌株均由本實(shí)驗(yàn)室分離、純化和鑒定,并于-70 ℃甘油保存;胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)及固體培養(yǎng)基(TSA)、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)(BP)購自青島海博生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌總RNA提取試劑盒、溶菌酶購自天根生化科技有限公司;Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo scientific公司;SsoAdvancedTMSYBR? GREEN Supermix購自Bio-Rad公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)購自Amresco公司。

Eppendorf 5804R型冷凍離心機(jī)Eppendorf;HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;Phs-4C+酸度計(jì)成都世紀(jì)方舟科技有限公司;BioSpec-nano230V核酸測定儀、CFX96熒光定量PCR儀Bio-Rad公司。

1.2無菌肉的制備

成都某菜市場購買新鮮豬肉,處理成形態(tài)均勻約1 g的肉粒,按照每10 g一小袋進(jìn)行分裝,送四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所輻照處理(鈷-60γ射線,25 kGy輻照),隨機(jī)取10 g輻照處理后的豬肉置于90 mL滅菌冷卻后的生理鹽水中,37 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)10 min,10倍梯度稀釋后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),以確保輻照處理后的豬肉處于無菌狀態(tài),隨后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SA005、SA008以及SAB0在豬肉上的生長與豬肉pH的測定

為了模擬實(shí)際環(huán)境較低染菌量情況下S.aureus在肉中生長情況,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了多次初始接菌量條件的探索。將于-70 ℃甘油保存的三株菌株的菌液解凍后,取50 μL接種到5 mL的TSB 培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min,培養(yǎng)4 h,增菌后的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋,將輻照后的每一小袋無菌肉(10 g)分別置于上述經(jīng)過稀釋的菌液中進(jìn)行染菌處理,振蕩混勻后,用滅過菌的鑷子將染菌的肉粒取出,置于90 mL無菌生理鹽水中,37 ℃恒溫?fù)u床150 r/min振蕩培養(yǎng)30 min,使肉粒上污染的細(xì)菌充分進(jìn)入到液體環(huán)境中,取1 mL處理后的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋,平板計(jì)數(shù)確定每個(gè)梯度肉上污染的細(xì)菌數(shù),多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4 h培養(yǎng)后的菌液稀釋到10-7后,進(jìn)行染菌處理能保證實(shí)驗(yàn)過程中初始接菌量為100～101CFU/g。實(shí)驗(yàn)時(shí),將染菌處理后的肉粒,用滅過菌的鑷子取出置于無菌的空三角瓶中,37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)的0～120 h每隔12 h向盛有10 g染菌肉粒的三角瓶中倒入90 mL滅菌的生理鹽水,150 r/min振蕩30 min,使肉粒表層的菌體進(jìn)入液體環(huán)境,取1 mL處理后的菌液10倍梯度稀釋進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)以及pH測定,每個(gè)測定時(shí)間點(diǎn)均做三次平行。

1.4RNA提取

在生長的12、24、36、48、60、72、96、108及120 h,向盛有10 g染菌肉粒的三角瓶中倒入90 mL滅菌的生理鹽水,150 r/min振蕩30 min,使肉粒表層的菌體進(jìn)入液體環(huán)境,靜置5 min,收集上層懸浮液中的菌體,4 ℃,12000 r/min離心2 min,棄上清,將菌體于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。RNA提取時(shí),取500 μL無菌1×TE緩沖液重懸菌體,加入溶菌酶37 ℃孵育過夜,然后采用細(xì)菌總RNA提取及純化試劑盒提取不同時(shí)間點(diǎn)樣品的總RNA。所用耗材、器皿均用DEPC水(1∶1000)處理并滅菌。

1.5反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR

按照Revert Aid First Strand cDNA合成試劑盒要求,將不同時(shí)間點(diǎn)提取的三株菌株的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件為42 ℃,60 min;70 ℃,5 min。得到的cDNA 產(chǎn)物采用BioSpec-nano230V核酸測定儀測定核酸濃度。

用于熒光定量PCR的腸毒素sek引物參照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上的基因序列(登錄號GQ358928),采用Primmer 6.0軟件自行設(shè)計(jì),并用BLAST比對特異性,具體sek-F 5′-TATATGGCGGAGTCACAGCTA-3′;sek-R 5′-TTTTTAGTGCCGTTATGTCC-3′。內(nèi)標(biāo)基因參考文獻(xiàn)[20],具體ftsz-F5′-TGAAGATGCAATCCAAGGTG-3′;ftsz-R 5′-GTTAATGCGCCCATTTCTTT-3′。所有引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

熒光定量PCR的反應(yīng)體系為10 μL,包括腸毒素sek或ftsz基因正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA模板1 μL,SYBR GREEN Supermix 5 μL,RNase free water 3 μL;在CFX96 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95 ℃,2 min;95 ℃,10 s、61.4 ℃(ftsz)/61.3 ℃(sek),30 s,共39個(gè)循環(huán),每個(gè)樣品各做3次平行,得到腸毒素sek和ftsz基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及不同取樣點(diǎn)所對應(yīng)的Ct值。

1.6腸毒素sek相對定量分析

1.7數(shù)據(jù)分析

生長過程中不同取樣點(diǎn)豬肉pH以及豬肉上接種的S.aureus平板計(jì)數(shù)所獲得的三個(gè)平行數(shù)據(jù),均采用Excel軟件處理。三株菌株腸毒素基因sek和內(nèi)參基因ftsz在不同時(shí)間點(diǎn)的Ct值,應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行初步整理后,使用SPSS 18.0數(shù)據(jù)分析軟件處理,采用單因素ANOVA分析組間差異性,組內(nèi)計(jì)量資料比較采用Duncan方法,以p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果與分析

2.1SA005、SA008和SAB0在豬肉上的生長情況

SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長情況詳見圖1。三株菌在豬肉上的生長趨勢較為相似,前48 h,SA005的生長速度明顯要快于SAB0和SA008;在豬肉上生長的24 h時(shí),通過平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示三株菌的菌落總數(shù)已經(jīng)達(dá)到106CFU/g以上;36 h以后三株菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期,108 h后細(xì)菌數(shù)量逐漸下降。另一方面,豬肉污染S.aureus孵育120 h,隨著時(shí)間的延長,豬肉的顏色改變明顯,在48 h時(shí)已出現(xiàn)肉眼可見的S.aureus的菌體聚集,隨后S.aureus的數(shù)量不斷增加,到120 h肉的形態(tài)已經(jīng)完全發(fā)生變化,肉粒本身變得粘稠,表層被菌體覆蓋,并有很濃稠的黏液析出。其中,SA005和SA008在豬肉中的生長要好一些,最大生長量的數(shù)量級可以到達(dá)109CFU/g,而SAB0只能達(dá)到107CFU/g。

圖1　SA005、SA008和SAB0在豬肉中生長曲線Fig.1　The growth curves of S. aureus SA005,SA008 and SAB0 in pork

2.2SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長肉的pH變化

三株菌在豬肉上0～120 h的生長過程中,測定各時(shí)間點(diǎn)豬肉在無菌生理鹽水中pH的變化趨勢詳見圖2。在檢測的120 h內(nèi),前36 h的pH變化不太明顯(6.0左右),36～84 h呈緩慢上升(7.0～8.0之間),84～120 h變化較快,120 h時(shí)最終達(dá)到8.85±0.31～9.14±0.29。而未染菌對照組豬肉的pH始終保持在6.0左右。

圖2　SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長不同時(shí)間肉的pH變化Fig.2　The pH value of pork inoculated with S. aureus SA005,SA008 and SAB0 at different time

2.3SA005、SA008和SAB0在豬肉上生長時(shí)sek基因的相對表達(dá)量

通過熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出ftsz基因的擴(kuò)增效率為E=96.9%,sek基因的擴(kuò)增效率為E=87%。隨后對所得不同時(shí)間點(diǎn)的Ct值進(jìn)行處理,得到SA005、SA008和SAB0三株菌株sek基因在豬肉上生長的相對表達(dá)情況,詳見圖3。三株S.aureus的sek表達(dá)量在細(xì)菌生長的對數(shù)期有一次高表達(dá),隨后表達(dá)量下降,在生長的穩(wěn)定后期表達(dá)量再次升高,其中,SA005的sek基因在細(xì)菌的生長過程中表達(dá)量明顯高于SA008和SAB0。通過單因素ANOVA分析可知,sek在不同菌株中表達(dá)差異極顯著(p<0.01);Duncan分析發(fā)現(xiàn)三株菌株的sek基因轉(zhuǎn)錄水平最高的時(shí)間點(diǎn)分別為96 h(SA005),12 h(SA008)和108 h(SAB0)。SA005的sek基因在12和48 h取樣點(diǎn)的相對表達(dá)量低;SA008的sek基因在24～72 h表達(dá)量相對比較穩(wěn)定,差異不顯著(p>0.05),除去12 h表達(dá)最高點(diǎn)之后,24～120 h的表達(dá)量呈現(xiàn)平緩的拋物線趨勢;而SAB0的sek基因在36～72 h之間相對表達(dá)量較低且差異不顯著(p>0.05),但在對數(shù)期和穩(wěn)定后期的表達(dá)量較高。

圖3　SA005、SA008和SAB0三株菌株在不同取樣點(diǎn)的sek基因相對表達(dá)情況Fig.3　The relative expression of sek gene at differentsampling times for S. aureus SA005,SA008 and SAB0

3　討論與結(jié)論

目前,對于新出現(xiàn)的腸毒素與食物中毒之間的聯(lián)系還不明確。學(xué)者指出S.aureus新出現(xiàn)的腸毒素可能是食品安全潛在的風(fēng)險(xiǎn)因子,應(yīng)該加大對這類腸毒素的研究[18]?；谛滦湍c毒素sek基因在MRSA菌株中的攜帶率很高,攜帶sek基因的菌株引起的食物中毒可能比其它腸毒素難治療[10,15-16];另一方面,葡萄球菌腸毒素引起食源性疾病的食物中,豬肉及豬肉制品位居第三,占所有檢測食物中毒樣本的10.6%[1]。因此,本研究重點(diǎn)放在攜帶sek基因的S.aureus在豬肉上的生長以及此過程中sek基因在mRNA水平上的相對表達(dá)量。

本文首先對三株菌株在豬肉上的生長進(jìn)行監(jiān)測,在模擬實(shí)際生活中低菌量情形下,三株S.aureus的生長趨勢較為接近,36 h以后細(xì)菌在豬肉上生長進(jìn)入穩(wěn)定期。特別提醒的是在24 h時(shí)對三株菌在豬肉上生長情況進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)量已經(jīng)從初始接菌量100～101CFU/g達(dá)到106CFU/g以上,而此時(shí)豬肉的外形與12 h相比沒有發(fā)生明顯變化,這種情況將成為金黃色葡萄球菌食物中毒的潛在威脅。先前的研究基于三株菌在TSB液體培養(yǎng)基中的生長,細(xì)菌在18 h就可進(jìn)入穩(wěn)定期[22],而三株菌在肉上的生長則在36 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期,說明三株菌在豬肉中的生長速度明顯要慢于TSB培養(yǎng)基肉湯。另外,還發(fā)現(xiàn)接種了S.aureus的豬肉在培養(yǎng)的120 h內(nèi)的pH隨著時(shí)間的推移也由弱酸性逐漸升高至堿性,對照未染菌組豬肉的pH幾乎不變一直保持在弱酸性,pH的升高可能是由于污染的S.aureus在豬肉上生長引起代謝產(chǎn)物的變化而引起。對于S.aureus在豬肉上生長時(shí)sek基因在mRNA水平上相對表達(dá)量的研究,本文采用了改良的2-ΔΔCt法進(jìn)行分析,并對擴(kuò)增引物的效率值E進(jìn)行了校正,提高了結(jié)果分析的準(zhǔn)確性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),盡管在豬肉上培養(yǎng)時(shí)三株菌株的sek基因全程表達(dá)(12～120 h),但相對表達(dá)量卻存在明顯差異;三株S.aureus的sek表達(dá)量在細(xì)菌生長的對數(shù)期有一次高表達(dá),隨后表達(dá)量下降,在生長的穩(wěn)定后期表達(dá)量再次升高。在液體培養(yǎng)基中腸毒素基因的表達(dá)情況,腸毒素的表達(dá)高峰出現(xiàn)在細(xì)菌生長的對數(shù)期或向穩(wěn)定期轉(zhuǎn)化的過程[[19,22-25]。Wallin-Carlquist等[26]研究了S.aureus分別接種于加工肉制品和純培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)腸毒素sea的表達(dá)均在對數(shù)生長期向穩(wěn)定期轉(zhuǎn)變過程到達(dá)高峰值。對于本文的sek基因來說,三株菌在豬肉上生長,sek基因前期的高表達(dá)確實(shí)出現(xiàn)在細(xì)菌生長的對數(shù)期或向穩(wěn)定期轉(zhuǎn)化的過程,這一點(diǎn)與學(xué)者們的報(bào)道非常吻合。本研究測定的時(shí)間較長,達(dá)到了120 h,因此,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在豬肉上生長的后期,又出現(xiàn)了另外的高表達(dá)時(shí)期。Márta等[27]對傳統(tǒng)腸毒素sed研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,其發(fā)現(xiàn)不同火腿產(chǎn)品中S.aureusSED的毒素產(chǎn)生存在差異,并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,熟肉以及煙熏肉中sed表達(dá)量出現(xiàn)了二次增長現(xiàn)象。腸毒素屬于細(xì)菌的次級代謝產(chǎn)物,腸毒素出現(xiàn)多次高表達(dá)現(xiàn)象可能與細(xì)菌的生長和代謝產(chǎn)物的積累有關(guān)。

此外,S.aureus在豬肉中生長時(shí),同時(shí)攜帶傳統(tǒng)腸毒素seb和sek基因的菌株SA005的sek基因表達(dá)量要明顯高于其它兩株不含seb基因的菌株SA008和SAB0。Aguilar等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象,他們認(rèn)為攜帶seb基因的菌株中,SEK蛋白的表達(dá)水平要高于未攜帶seb基因的菌株。說明在相同培養(yǎng)條件下,不同菌株由于自身攜帶腸毒素基因背景不同,也可能導(dǎo)致菌株sek基因在mRNA水平上表達(dá)量的差異。除了菌株本身的內(nèi)在因素外,環(huán)境因素對腸毒素基因的表達(dá)也存在一定程度的影響,因此,改變細(xì)菌的生長環(huán)境可以間接地影響細(xì)菌毒素的產(chǎn)生。未來的研究可以通過增加食物的種類來證實(shí)此觀點(diǎn)。

本研究存在的缺陷是只針對三株細(xì)菌在生長的12～120 h進(jìn)行取樣監(jiān)測,而12 h前細(xì)菌sek基因在豬肉上的表達(dá)情況沒有反映出來。另一方面是沒有按照實(shí)際生活中豬肉的放置溫度,設(shè)置冷凍、冷藏和室溫等條件下S.aureus的相關(guān)數(shù)據(jù),未來的研究工作將進(jìn)一步豐富實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本文未能對豬肉中的SEK毒素蛋白含量進(jìn)行檢測,主要原因是目前還沒有可以檢測SEK毒素蛋白的商業(yè)試劑盒出現(xiàn),實(shí)驗(yàn)室正在加快這方面的研究,期望以后可將毒素蛋白的檢測和轉(zhuǎn)錄水平的檢測進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

綜上,本研究通過了解S.aureus腸毒素sek基因在豬肉中的表達(dá),為攜帶sek基因的S.aureus引起食物中毒的評估以及菌株關(guān)聯(lián)的毒性風(fēng)險(xiǎn)提供新的線索和基礎(chǔ)數(shù)據(jù),至于新型腸毒素存在的潛在中毒能力還有待于進(jìn)一步評價(jià)。

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The growth ofStaphylococcusaureuson pork and the temporal expression of staphylococcal enterotoxin K(sek)gene

WANG Qiong,ZHANG Rong,CHEN Juan,LONG Hu,TANG Jun-ni*

(College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

Objective:This study was to elucidate the growth ofStaphylococcusaureuson pork and temporal expression of staphylococcal enterotoxin K(sek)gene. Methods:ThreeS.aureusstrains(SA005,SA008 and SAB0)withsekgene from foodborne isolates in our lab were inoculated on pork. The growth curves and pH values change of three strains were monitored for 120 h during the growth phases on pork. Total RNAs from three strains were extracted at different time,and a quantitative real time-PCR was developed to monitorsekrelative expression levels. Results:The three strains ofS.aureusentered the static growth phase on pork after 36 h. VisibleS.aureusbacteria gathered on pork meat around at 48 h and the pork became sticky and had mucus at 120 h. The pH values of pork did not change too much before 36 h. Until 120 h,the pH values of pork changed to 8.85～9.14. Thesekexpression levels of three strains on pork had a high-expression in exponential phase,then decreased,and later increased again. Especially,thesekexpression of SA005 was obviously higher than those of SA008 and SAB0(p<0.01). Conclusion:Continuous expression ofsekgene in three strains on pork was observed during the whole incubation period,however,the relative expression levels ofsekgene among three strains had significant differences. The high transcription levels ofsekgene inS.aureuson pork would bring a potential threat on food safety.

Staphylococcusaureus;pork;sekgene;real time-PCR;temporal expression

2015-11-09

王瓊(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工與安全，E-mail:wangqiong528@163.com。

唐俊妮(1971-)，女，教授，研究方向：食品安全與食品微生物，E-mail:junneytang@aliyun.com。

國家自然科學(xué)基金(31371781)；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)(2014JY0253)；2014年度教育部回國留學(xué)啟動(dòng)項(xiàng)目；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015NZYQN59)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)12-0190-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.028