重組大腸桿菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

舒　暢,羅水忠,2,蔡　靜,2,姜紹通,2,鄭　志,2,*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽合肥 230009;2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230009)

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重組大腸桿菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

舒暢1,羅水忠1,2,蔡靜1,2,姜紹通1,2,鄭志1,2,*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽合肥 230009;2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230009)

以谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)菌株重組大腸桿菌BL21(DE3)/mtg為研究對(duì)象,對(duì)工程菌的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法,對(duì)培養(yǎng)基碳、氮源種類及濃度、培養(yǎng)溫度、初始pH、裝液量、接種量、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化;隨后采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從中篩選出3個(gè)關(guān)鍵影響因子:初始pH、培養(yǎng)溫度及誘導(dǎo)溫度;最后通過(guò)Box-Benhnken設(shè)計(jì)建立上述3個(gè)因子對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶比酶活的響應(yīng)面模型。結(jié)果表明,最佳發(fā)酵條件為:葡萄糖5 g/L,酵母粉28 g/L,蛋白胨14 g/L,培養(yǎng)溫度34 ℃,初始pH7.0,裝液量50 mL(250 mL三角瓶),接種量5%,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)4 h,IPTG濃度0.6 mmol/L,誘導(dǎo)溫度25 ℃,誘導(dǎo)時(shí)間14 h。在該條件下,優(yōu)化后的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶比酶活達(dá)1.507 U/mg,為未優(yōu)化前的1.56倍。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,重組大腸桿菌,發(fā)酵優(yōu)化,響應(yīng)面法

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶,它以谷氨酰胺殘基γ-羧酰胺基為?；w,催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間的交聯(lián),蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解,從而極大地改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[1],在肉制品、水產(chǎn)品和乳制品[2]等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景,被譽(yù)為“21世紀(jì)超級(jí)粘合劑”。

TGase最初從動(dòng)[3]、植物組織[4]中提取,但工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低、分離成本高,不利于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。自1989年Ando等[5]從茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)中分離得到微生物來(lái)源的TGase(MTGase,MTG),至今已有大量鏈霉菌屬[6]和芽孢桿菌屬[7]等菌種的發(fā)酵產(chǎn)酶研究。相比其他來(lái)源的TGase,MTG具有非Ca2+依賴性、催化效率高、底物特異性低、溫度穩(wěn)定性高[8]等特點(diǎn),且其生產(chǎn)周期短,易分離純化,成本優(yōu)勢(shì)明顯[9],故倍受研究者青睞。為提高M(jìn)TG產(chǎn)率,國(guó)內(nèi)外圍繞優(yōu)勢(shì)菌種選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化及基因工程菌構(gòu)建等方面展開了大量工作。目前,MTG已在大腸桿菌(Escherichiacoli)[10]、谷氨酸棒桿菌[11]、酵母[12]、枯草芽孢桿菌[13]和鏈霉菌等[14]宿主中成功表達(dá),但普遍存在酶活低、產(chǎn)量少等問(wèn)題。

本課題組在前期研究中將S.mobaraensis來(lái)源的TGase基因在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)。為探討以發(fā)酵法產(chǎn)MTG的可能性,本研究對(duì)重組大腸桿菌BL21(DE3)/mtg的發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化,為后續(xù)研究中試及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

含S.mobaraensisTGase基因的重組大腸桿菌BL21(DE3)/mtg由合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院谷物科學(xué)與食品發(fā)酵研究室構(gòu)建與保藏;CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸-γ-單羥肟酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;還原性谷胱甘肽、Tris、牛血清蛋白均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白胨、酵母粉均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司;卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LDZX-50KBS型立式滅菌器上海申安醫(yī)療器械有限公司;ZHJH-C1112B型超凈工作臺(tái)、ZWY-240型全溫型多振幅軌道搖床上海智城分析儀器制造有限公司;DHP-9012B型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SP-722E型可見分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所;CR22GII型高速冷凍離心機(jī)日本Hitachi公司;PH-108型筆式酸度計(jì)杭州陸恒生物科技有限公司;JY99-IIIBN型超聲波連續(xù)流細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基:LB/Kan培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,卡那霉素0.1,pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基:TB/Kan培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12,酵母粉24,K2HPO412.54,KH2PO42.31,甘油5,卡那霉素0.1,pH7.0。

1.2.2培養(yǎng)方法種子培養(yǎng):自-80 ℃保藏的甘油管中取適量菌液涂布LB平板,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種于50 mL種子培養(yǎng)基(250 mL三角瓶),37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)產(chǎn)酶:將培養(yǎng)好的種子液以5%的接種量接種到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL三角瓶)中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600為0.8時(shí)加入終濃度0.6 mmol/L的IPTG,26 ℃、200 r/min誘導(dǎo)16 h。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞密度值(OD600)及MTG比酶活為考察指標(biāo),依次以碳源種類(甘油、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉)、碳源濃度(2、4、5、6、8、10 g/L)、氮源種類(蛋白胨和酵母粉(1∶2)、氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素)、氮源濃度(1、2、4、5、6、8 g/L)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%)、裝液量(15、25、50、75、100 mL)(250 mL三角瓶)、培養(yǎng)溫度(26、30、34、37、41 ℃)、初始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)(IPTG添加時(shí)間:2、3、4、5、6、7 h)、誘導(dǎo)時(shí)間(13、14、15、16、17、18、19 h)及誘導(dǎo)溫度(22、26、30、34、37、41 ℃)為影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。初始實(shí)驗(yàn)條件為:甘油5 g/L、蛋白胨12 g/L、酵母粉24 g/L、接種量5%、裝液量50 mL、培養(yǎng)溫度37 ℃、初始pH7.0、IPTG濃度0.6 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)4 h、誘導(dǎo)時(shí)間16 h、誘導(dǎo)溫度26 ℃。除考察因素外,每次實(shí)驗(yàn)的其他因素條件均以前一實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)條件置換。

1.2.4Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)優(yōu)化在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行PB設(shè)計(jì),各因素選取2個(gè)水平,高水平約取低水平的1.25倍,響應(yīng)值為MTG比酶活。PB實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1　Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.5Box-Benhnken(BB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以PB實(shí)驗(yàn)篩選出的三個(gè)顯著因素(培養(yǎng)溫度、初始pH、誘導(dǎo)溫度)為實(shí)驗(yàn)因素,以MTG比酶活為響應(yīng)值,各因素選取3個(gè)水平,設(shè)計(jì)三因素三水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。BB實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2　Box-Benhnken(BB)實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.6分析方法

1.2.6.1細(xì)胞密度值的測(cè)定發(fā)酵液經(jīng)適度稀釋后,以無(wú)菌培養(yǎng)液為對(duì)照,于波長(zhǎng)600 nm處所測(cè)吸光值乘以稀釋倍數(shù)即為菌體濃度(OD600)。

1.2.6.2MTG比酶活的測(cè)定發(fā)酵液4 ℃、7000 r/min離心10 min,收集菌體于冰上超聲破碎10 min,4 ℃、16000 r/min離心15 min,收集上清即為粗酶液。按Grossowicz比色法[15]測(cè)定酶活:以CBZ-Gln-Gly為底物,L-谷氨酸-γ-單羥肟酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶單位活力(U)定義為:37 ℃時(shí)每分鐘催化底物生成 1 μmol L-谷氨酸-γ-單羥肟酸的酶量。比酶活(U/mg)定義為:每毫克蛋白具有的酶活力。蛋白含量測(cè)定參考Bradford法[16]。

1.3數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。應(yīng)用Microsoft Office Excel 2013和Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,Origin 8.5軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1碳源種類及濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響碳源為微生物生長(zhǎng)代謝提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來(lái)源。按含碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等的原則,分別以葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和可溶性淀粉來(lái)代替TB培養(yǎng)基中的甘油(5 g/L)為碳源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。由圖1可知,碳源為可溶性淀粉時(shí)菌體濃度最高,但MTG比酶活較低;葡萄糖為碳源時(shí)MTG比酶活最高,且菌體濃度僅次于淀粉。故選擇葡萄糖為最優(yōu)碳源,進(jìn)而考察其濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。由圖2可知,隨著葡萄糖濃度的增加,菌體濃度和MTG比酶活均先增加后減少,當(dāng)葡萄糖濃度為5 g/L時(shí),兩者均達(dá)最高值,分別為(4.49±0.46)和(1.13±0.08)U/mg。黃亞杰等[17]也有類似報(bào)道。

圖1　不同碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.1　Effect of different carbon sources on cell growth and MTG production

圖2　葡萄糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.2　Effect of glucose concentrations on cell growth and MTG production

2.1.2氮源種類及濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響氮源主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物的合成。按含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等的原則,分別以氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨和尿素來(lái)代替TB培養(yǎng)基中的復(fù)合氮源(總含氮量為4.2 g/L)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。由圖3可知,氮源種類對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶有較大影響,復(fù)合氮源明顯優(yōu)于其他氮源。據(jù)Harrison等[18]研究顯示,酵母粉對(duì)重組酶釋放至大腸桿菌周質(zhì)空間有明顯促進(jìn)作用。故保持蛋白胨和酵母粉復(fù)配比不變,進(jìn)而考察復(fù)合氮源總含氮量對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。由圖4可知,隨氮源濃度的增加,菌體濃度也增加,而MTG比酶活呈先增后減趨勢(shì)。當(dāng)復(fù)配氮源總含氮量為5 g/L(蛋白胨為14 g/L,酵母粉為28 g/L)時(shí),MTG比酶活達(dá)最大值,為(1.17±0.09)U/mg。

圖3　不同氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.3　Effect of different nitrogen sources on cell growth and MTG production

圖4　氮源濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.4　Effect of nitrogen concentrations on cell growth and MTG production

2.1.3接種量對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響接種量對(duì)發(fā)酵周期及溶氧量都有直接影響[17]。由圖5可知,當(dāng)接種量為5%時(shí),菌體濃度和MTG比酶活均最大。故選擇5%為最佳接種量。

2.1.4裝液量對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響裝液量影響菌株通氣狀況,適度的溶解氧是微生物代謝及產(chǎn)物合成的關(guān)鍵。由圖6可知,隨裝液量的增加,菌體濃度和MTG的比酶活均上升,在50 mL時(shí)達(dá)到最大值,隨后均降低。故選擇50 mL為最佳裝液量。

圖5　接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.5　Effect of inoculum sizes on cell growth and MTG production

圖6　裝液量對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.6　Effect of medium volumes on cell growth and MTG production

圖7　培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.7　Effect of temperatures on cell growth and MTG production

2.1.5培養(yǎng)溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響較高溫度時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)速率高,但易積累代謝副產(chǎn)物,抑制其生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)[19]。由圖7可知,37 ℃時(shí)菌體濃度最高,但34 ℃時(shí)MTG比酶活最高(1.32±0.16)U/mg,為前者的1.3倍。故選擇34 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.1.6初始pH對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響由圖8可知,pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶有較大影響。隨其增加,菌體濃度和MTG比酶活均先上升后下降,pH為7.0時(shí),兩者都為最大值。故選擇pH7.0為最佳初始pH。

圖8　初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.8　Effect of initial pH on cell growth and MTG production

2.1.7IPTG濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響由圖9可知,IPTG濃度為0.6 mmol/L時(shí),MTG比酶活最高,為(1.32±0.14)U/mg。故選擇0.6 mmol/L為最佳IPTG濃度。

圖9　IPTG濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.9　Effect of IPTG concentrations on cell growth and MTG production

2.1.8誘導(dǎo)時(shí)機(jī)(IPTG添加時(shí)間)對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響由圖10可知,在對(duì)數(shù)中期4 h添加IPTG,MTG比酶活最高,這與之前類似研究報(bào)道[20]一致。故選擇4 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。

圖10　IPTG添加時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.10　Effect of the adding time of IPTG on cell growth and MTG production

圖11　誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.11　Effect of induction time on cell growth and MTG production

2.1.9誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響由圖11可知,14 h時(shí)菌體濃度和MTG比酶活均為最高值,此后隨時(shí)間增加而降低。故選擇14 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

表3　PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.10誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響由圖12可知,22～37 ℃內(nèi)菌體濃度隨誘導(dǎo)溫度增加而增加,但低溫有利于重組大腸桿菌產(chǎn)物的表達(dá)[19],26 ℃時(shí)MTG的比酶活最高,故選擇26 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

圖12　誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.12　Effect of induction temperatures on cell growth and MTG production

2.2PB實(shí)驗(yàn)

PB設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3,方差分析見表4。模型p<0.05(0.0463),顯著可用。由表4可知,MTG比酶活的顯著影響因素依次為初始pH、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)溫度,其他因素對(duì)MTG比酶活影響較小。因此選擇以上三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

表4　PB設(shè)計(jì)方差分析

注:*表示差異顯著(p<0.05);**表示差異極顯著(p<0.01),表6同。

2.3BB實(shí)驗(yàn)

2.3.1BB設(shè)計(jì)及結(jié)果分析響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5,利用Design-Expert軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合所得方程為:

Y=1.5+0.013A+0.035B-0.093C+0.075AB-0.028AC+0.019BC-0.21A2-0.54B2-0.18C2。

回歸方程相關(guān)系數(shù)R2為0.993,說(shuō)明方程擬合較好,可用來(lái)分析各因素和MTG比酶活間的關(guān)系。由表6可知,回歸模型極顯著(p<0.0001),失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),模型可用。對(duì)MTG比酶活影響最顯著的因素為誘導(dǎo)溫度(C),其次為初始pH(B)和培養(yǎng)溫度(A)。除培養(yǎng)溫度、初始pH與誘導(dǎo)溫度交互項(xiàng)(BC)為顯著因素外,各因素及其交互作用(B、C、AB、AC、A2、B2、C2)都為極顯著性因素。

表5　BB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6　BB設(shè)計(jì)方差分析

2.3.2各因素間的交互作用初始pH與培養(yǎng)溫度、初始pH與誘導(dǎo)溫度、培養(yǎng)溫度與誘導(dǎo)溫度的交互作用對(duì)MTG比酶活影響的響應(yīng)面圖見圖13。由圖可知,響應(yīng)面陡峭,各因素間交互作用明顯。經(jīng)軟件分析計(jì)算得當(dāng)培養(yǎng)溫度為33.68 ℃、初始pH為7.02、誘導(dǎo)溫度為24.98 ℃時(shí),MTG比酶活的預(yù)測(cè)值最大,為1.511 U/mg。

圖13　各因素交互作用對(duì)MTG比酶活的交互影響Fig.13　Response surface plots of variable parameters on the specific activity of MTG

2.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)考慮實(shí)際操作的局限性,將上述預(yù)測(cè)最優(yōu)條件修正為:培養(yǎng)溫度34 ℃、初始pH7.0、誘導(dǎo)溫度25 ℃。該條件下所產(chǎn)MTG比酶活為(1.507±0.03)U/mg,與理論值接近,且在95%預(yù)測(cè)區(qū)間[1.44,1.59]內(nèi),說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面分析得到的條件較為可靠,具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3　結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burnman設(shè)計(jì)及Box-Benhnken設(shè)計(jì),對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)MTG的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,最佳發(fā)酵條件為:葡萄糖5 g/L,酵母粉28 g/L,蛋白胨14 g/L,接種量5%,裝液量50 mL(250 mL三角瓶),初始pH7.0,培養(yǎng)溫度34 ℃,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)4 h,IPTG濃度0.6 mmol/L,誘導(dǎo)溫度25 ℃,誘導(dǎo)時(shí)間14 h。優(yōu)化后的MTG比酶活為1.507 U/mg,為未優(yōu)化前的1.56倍。

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Optimization of the fermentation conditions for transglutaminase by recombinantEscherichiacoli

SHU Chang1,LUO Shui-zhong1,2,CAI Jing1,2,JIANG Shao-tong1,2,ZHENG Zhi1,2,*

(1.School of Food Science and Engineering,Hefei 230009,China;2.Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province,Hefei 230009,China)

The paper investigated the improvement of the production of microbial transglutaminase(MTGase,MTG)by recombinantEscherichiacoliBL21(DE3)/mtg in 250 mL shake flasks. Using single factor experiment,the types and the concentrations of carbon sources and nitrogen sources of the media,the inoculum sizes,the medium volumes,the culture temperature,the initial pH,the inducer concentration,the adding time of inducer,the induction temperature and the induction time were optimized,respectively. Among the above factors,3 key factors,the culture temperature,the initial pH and the induction temperature,were selected by Plackett-Burman design. And a response surface model of the 3 factors and the specific activity of MTG were constructed by Box-Benhnken design. The optimal conditions were as follows,the media contained 5 g/L of glucose,28 g/L of yeast extract and 14 g/L of tryptone,and the bacteria were cultured in 50 mL(250 mL triangle bottle),pH7.0 optimized media at 34 ℃ for 4 h with 5%(v/v)inocula and were induced by 0.6 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 14 h. Under the optimal conditions,the maximum specific activity of MTG was 1.507 U/mg,which was 1.56 times larger than the MTG produced in initial conditions.

transglutaminase;recombinantEscherichiacoli;fermentation optimization;response surface method

2016-01-04

舒暢(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：allison_shu@163.com。

鄭志(1971-)，男，博士，教授，研究方向：谷物科學(xué)，E-mail：zhengzhi@hfut.edu.cn。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA102201)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)12-0183-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.027