復(fù)合菌系的構(gòu)建及其對(duì)玉米秸稈預(yù)處理的研究

魏如騰,侯紅萍,白春艷

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太谷 030801)

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復(fù)合菌系的構(gòu)建及其對(duì)玉米秸稈預(yù)處理的研究

魏如騰,侯紅萍*,白春艷

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太谷 030801)

黑曲霉,芽孢桿菌,里氏木霉,解脂假絲酵母,復(fù)合菌系,玉米秸稈

纖維素是地球上最豐富的多糖化合物,廣泛存在于植物中,有資料表明,全世界每年生產(chǎn)纖維素及半纖維素的總量為850億t。其中大部分農(nóng)作物秸稈還是以焚燒的形式被處理掉,這不僅造成大量資源的浪費(fèi),還造成環(huán)境污染。近年來(lái),隨著人口增長(zhǎng)、糧食短缺、石油危機(jī)等的出現(xiàn),將纖維素水解為小分子單糖,單糖再通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種有用的產(chǎn)品顯得尤為重要。

秸稈預(yù)處理方法很多,其中物理、化學(xué)和生物預(yù)處理應(yīng)用較廣泛,原理都是借助外力改善秸稈的質(zhì)地和結(jié)構(gòu)。物理和化學(xué)預(yù)處理已有很多研究,但這兩種方法會(huì)增加費(fèi)用且易造成二次污染。生物預(yù)處理是在人工控制下,利用一些微生物的分解作用破壞秸稈的大分子物質(zhì),具有高效清潔的優(yōu)點(diǎn)[1]。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑曲霉種子培養(yǎng)基、里氏木霉種子培養(yǎng)基、芽孢桿菌種子培養(yǎng)基、液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基配制方法參考文獻(xiàn)[3]。

PHS-25C型數(shù)字酸度計(jì)上海人普儀器有限公司;TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司;722E型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;HP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱北京光明醫(yī)療儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1纖維素酶活力的測(cè)定以水解濾紙的酶活力代表纖維素酶的總活力(FPA酶活),以水解羧甲基纖維素的活力代表葡聚糖內(nèi)切酶的活力(CMC酶活)[4]。

1.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用無(wú)水葡萄糖(分析純,105 ℃下烘干至恒重)配制成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于比色管中,補(bǔ)水至2.0 mL,加入2.0 mL DNS試劑,蓋上蓋,沸水浴5 min,立即冷卻,終止反應(yīng),定容至25 mL,搖勻后,在550 nm處測(cè)定吸光值(OD值),每管重復(fù)測(cè)3次,結(jié)果取平均值。以吸光值為縱坐標(biāo),葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)繪制曲線圖并建立回歸方程,見(jiàn)圖1所示。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of glucose

1.2.3葡聚糖內(nèi)切(CMC)酶活力的測(cè)定方法取25 mL比色管,加入適當(dāng)稀釋的上清酶液0.5 mL和1.0 mL濃度為1%的CMC-Na溶液,再加1.0 mL用pH4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制成1%(w/v)的羧甲基纖維素懸浮液,蓋上蓋子。在50 ℃、振幅80的條件下水浴30 min。取出后迅速加入2.0 mL DNS溶液,之后沸水浴5 min,水浴后立刻取出用流動(dòng)水冷卻并定容至25 mL,混勻,在550 nm處測(cè)OD值。

1.2.4濾紙(FPA)酶活力的測(cè)定方法取25 mL比色管,以1 cm×6 cm(50±1) mg的新華濾紙條為底物,加入適當(dāng)稀釋的上清酶液0.5 mL和pH4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,蓋上蓋子。在50 ℃、振幅80的條件下水浴30 min。取出后迅速加入2.0 mL DNS溶液,之后沸水浴5 min,水浴后立刻取出用流動(dòng)水冷卻并定容至25 mL,混勻,在550 nm處測(cè)OD值。

1.2.5酶活定義在一定的溫度及pH條件下,1 min從底物溶液中分解產(chǎn)生1 μg還原糖所需要的酶量即為一個(gè)酶活單位,簡(jiǎn)稱為U[5]。

1.3各菌株的產(chǎn)纖維素酶情況

1.3.1芽孢桿菌T7.0產(chǎn)酶情況將芽孢桿菌T7.0按6%接種量接種于裝有50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,33 ℃、140 r/min發(fā)酵5 d,分別測(cè)定其CMC酶活和FPA酶活[2]。

1.3.3里氏木霉產(chǎn)纖維素酶情況將里氏木霉按10%接種量接種于裝有50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃、140 r/min發(fā)酵5 d,分別測(cè)定其CMC酶活和FPA酶活[2]。

1.4三株菌復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶情況

1.5復(fù)合菌不同接種方式對(duì)酶活的影響

不同酶組分分泌的纖維素酶類(lèi)型不同,酶活也不盡相同,故復(fù)合菌系可提高降解纖維素效率[7]。在接種總量一定的條件下,通過(guò)改變復(fù)合菌的接種方式,改變不同酶組分的產(chǎn)量,從整體上提高纖維素的降解能力。另外,某一菌種所分泌的代謝產(chǎn)物也有可能成為其它菌種生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分,從而加快菌種生長(zhǎng)并分泌纖維素酶[7]。

1.6復(fù)合菌對(duì)不同秸稈降解效果的研究

將復(fù)合菌按9%接種量(芽孢桿菌T7.0∶黑曲霉Z34∶里氏木霉=2∶1∶2)接入裝有100 mL混合產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,分別以玉米秸稈、小麥秸稈、黃豆秸稈(均過(guò)40目),于31 ℃、140 r/min條件下發(fā)酵5 d,測(cè)其CMC酶活力。

表2　復(fù)合菌之間的接種比例Table 2　The proportion of Inoculation among the compound bacteria

1.7解脂假絲酵母對(duì)玉米秸稈進(jìn)行生物預(yù)處理效果的研究

1.7.1玉米秸稈預(yù)處理時(shí)間對(duì)降解效果的影響將解脂假絲酵母的種子培養(yǎng)液按2%接種量接入玉米秸稈產(chǎn)酶培養(yǎng)基,分別處理0、12、24、36、48、60 h以后接入復(fù)合菌,于31 ℃、140 r/min下發(fā)酵5 d,測(cè)其CMC酶活。

表1　復(fù)合菌的接種順序Table 1　Inoculation sequence of compound bacteria

1.7.2解脂假絲酵母接種量對(duì)降解效果的影響將解脂假絲酵母的種子培養(yǎng)液分別按1%、2%、3%、4%、5%接種量接入玉米秸稈產(chǎn)酶培養(yǎng)基,處理36 h后接入復(fù)合菌,于31 ℃、140 r/min下發(fā)酵5 d,測(cè)其CMC酶活。

1.7.3玉米秸稈粉碎度對(duì)降解效果的影響將解脂假絲酵母的種子培養(yǎng)液按2%接種量接入不同粉碎度的玉米秸稈(10、20、30、40、50、60、70目)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,處理36 h后接入復(fù)合菌,于31 ℃、140 r/min下發(fā)酵5 d,測(cè)其CMC酶活。

1.8正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Minitab16軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，根據(jù)三因素三水平試驗(yàn)對(duì)解脂假絲酵母和復(fù)合菌共同發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行優(yōu)化。因素水平表見(jiàn)3。

表3　正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 3　Factors and levels of the orthogonal test

2　結(jié)果與分析

2.1各菌株的產(chǎn)纖維素酶情況

2.1.1芽孢桿菌T7.0產(chǎn)酶情況從圖2可以看出芽孢桿菌T7.0在第1 d時(shí),FPA酶活比CMC酶活高,第2 d CMC酶活力和FPA酶活力開(kāi)始升高,當(dāng)?shù)? d時(shí)CMC和FPA酶活力活力均達(dá)到最高,分別為128.06、121.75 U/mL,從第4 d開(kāi)始兩種酶活開(kāi)始下降,可能是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗,代謝產(chǎn)物積累,導(dǎo)致活力下降。

圖2　芽孢桿菌T7.0產(chǎn)纖維素酶的情況Fig.2　The enzyme production of Bacillus T7.0

圖3　黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的情況Fig.3　The enzyme production of aspergillus niger

2.1.3里氏木霉產(chǎn)纖維素酶情況從圖4可以看出第1 d菌體生長(zhǎng)旺盛,在第2 d時(shí)活力達(dá)到最高,CMC酶活力和FPA酶活力分別為157.61、174.86 U/mL,從第3 d開(kāi)始,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、菌體老化、產(chǎn)物抑制等原因造成酶活力下降。

由上述結(jié)果可知,若將不同菌種進(jìn)行混合培養(yǎng),優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),有利于完善纖維素酶組分、提高酶活、縮短產(chǎn)酶周期、提高纖維素降解效率[8]。

表4　復(fù)合菌的接種順序?qū)MC酶活的影響Table 4　Effects of inoculation sequence of compound bacteria on CMC enzyme activity

表5　復(fù)合菌的接種比例對(duì)酶活的影響Table 5　Effects of the proportion of the compound bacteria on the activity of the enzyme

圖4　里氏木霉產(chǎn)纖維素酶情況Fig.4　The enzyme production of Trichoderma reesei

2.2三株菌復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶情況

圖5　復(fù)合菌產(chǎn)酶活力測(cè)定Fig.5　Determination of the activity of the compound bacteria producing enzyme

2.3復(fù)合菌不同接種方式對(duì)酶活的影響

2.3.2復(fù)合菌的接種比例對(duì)酶活的影響由表5可知,接種比例不一樣,其CMC酶活存在差異,實(shí)驗(yàn)7(黑曲霉Z34∶里氏木霉∶芽孢桿菌T7.0=2∶1∶2)的酶活最高,達(dá)到365.98 U/mL,比實(shí)驗(yàn)1高出12.99%。

2.4復(fù)合菌對(duì)不同秸稈降解效果的研究

從圖6可以看出復(fù)合菌對(duì)玉米秸稈的降解效果明顯高于小麥秸稈與黃豆秸稈,達(dá)到388.18 U/mL。后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了復(fù)合菌對(duì)玉米秸稈的降解效果。

圖6　復(fù)合菌對(duì)不同秸稈降解效果的影響Fig.6　Effect of compound bacteria on the degradation of different straw

2.5解脂假絲酵母對(duì)玉米秸稈進(jìn)行生物預(yù)處理效果的研究

2.5.1玉米秸稈預(yù)處理時(shí)間對(duì)降解效果的影響由圖7可知,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),CMC酶活力逐漸增大,當(dāng)達(dá)到36 h時(shí)活力達(dá)到最高點(diǎn),并且酶活力基本趨于穩(wěn)定。

圖7　玉米秸稈預(yù)處理時(shí)間對(duì)降解效果的影響Fig.7　Effect of pretreatment time on degradation of corn stalk

2.5.2解脂假絲酵母接種量對(duì)降解效果的影響從圖8可知,當(dāng)解脂假絲酵母接種量為2%時(shí),CMC酶活力最高,接種量小,在規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),有限的解脂假絲酵母種子液不足以萌發(fā)足夠的菌體,菌體生長(zhǎng)緩慢,產(chǎn)酶活力低;而接種量大,導(dǎo)致菌體過(guò)多,培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌體自身的生長(zhǎng)繁殖,產(chǎn)酶活力也較低。

表7　正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 7　Variance analysis of the orthogonal test

圖8　解脂假絲酵母接種量對(duì)降解效率的影響Fig.8　Effect of inoculation amount on degradation efficiency of Candida lipolytica

2.5.3玉米秸稈粉碎度對(duì)降解效果的影響從圖9可以看出,隨著秸稈粉碎度的越來(lái)越大,CMC酶活力也逐漸變大。當(dāng)秸稈粉碎度為30目時(shí),相比10目時(shí)提高了8.04%,粉碎度為40目時(shí),相比10目時(shí)提高了8.96%,而秸稈粉碎度40目相比30目只提高了0.85%,考慮到生產(chǎn)應(yīng)用,減少成本以及機(jī)械損耗[9],選擇玉米秸稈粉碎度為30目。

圖9　玉米秸稈粉碎度對(duì)降解效果的影響Fig.9　Effects of corn stalk crushing degree on the degradation effect

2.6正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

從表6可以看出各因素對(duì)CMC酶活的影響大小依次為接種量>時(shí)間>粉碎度。最佳組合是A2B2C3,即:時(shí)間36 h、接種量2%、粉碎度40目。

根據(jù)表6可以確定,理論上的最優(yōu)組合是A2B2C3,這個(gè)組合與5號(hào)實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)組合A2B2C3相同,因此,可以確定最優(yōu)組合是A2B2C3,即時(shí)間36 h、接種量2%、粉碎度40目,此時(shí)酶活力為408.55 U/mL,但是考慮到大規(guī)模生產(chǎn)的生產(chǎn)成本以及機(jī)械損耗,組合A2B2C2(酶活力為404.28U/mL),即時(shí)間36 h、接種量2%、粉碎度30目,帶來(lái)的效益要比組合A2B2C3大,所以選擇組合A2B2C2,即時(shí)間36h、接種量2%、粉碎度30目。

從表7可知,各因素對(duì)酶活的影響大小依次是:接種量、時(shí)間、粉碎度,其中時(shí)間、接種量對(duì)酶活影響極顯著,粉碎度影響不顯著。

3　結(jié)論

表6　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6　Results and analysis of orthogonal test

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Construction of composite microbial systems and its effect on corn stalk pretreatment

WEI Ru-teng,HOU Hong-ping*,BAI Chun-yan

(Food Science and Engineering College,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

Aspergillusniger;Bacillus;Trichodermareesei;Candidalipolytica;composite microbial systems;corn stalk

2015-09-02

魏如騰(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：食品微生物與發(fā)酵技術(shù),E-mail:weiruteng565@163.com。

侯紅萍(1965-)，女，碩士，教授，研究方向：食品與發(fā)酵工程技術(shù)：E-mail:sphhping@126.com。

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(201403110192)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)05-0177-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.026