阿魏側(cè)耳胞外多糖對小鼠巨噬細胞的激活作用

王　晶,張春丹,楊利敏,解春艷,杜　娟,閆訓友,吳智艷，*

(1.廊坊師范學院生命科學學院,河北廊坊 065000; 2.河北省高校食藥用菌應用技術(shù)研發(fā)中心,河北廊坊 065000; 3.廊坊市食用菌技術(shù)重點實驗室,河北廊坊 065000)

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阿魏側(cè)耳胞外多糖對小鼠巨噬細胞的激活作用

王晶1，2，3,張春丹1,楊利敏1,解春艷1，2，3,杜娟1，2，3,閆訓友1，2，3,吳智艷1，2，3，*

(1.廊坊師范學院生命科學學院,河北廊坊 065000; 2.河北省高校食藥用菌應用技術(shù)研發(fā)中心,河北廊坊 065000; 3.廊坊市食用菌技術(shù)重點實驗室,河北廊坊 065000)

利用巨噬細胞體外培養(yǎng)體系,研究阿魏側(cè)耳胞外多糖對小鼠巨噬細胞的激活作用。無菌獲得小鼠腹腔巨噬細胞,中性紅吞噬實驗檢測細胞吞噬活性;熒光探針標記和Griess反應分別檢測細胞內(nèi)外NO的含量,酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞內(nèi)一氧化氮合成酶(NOS)、培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)和白細胞介素12(IL-12)的含量。結(jié)果表明,與空白組相比,25～200 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖可顯著增強巨噬細胞的吞噬活性(p<0.05),增加細胞因子IL-1(p<0.05)和IL-12(p<0.05)的分泌量;50～200 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖可顯著提高細胞NOS(p<0.05)和NO(p<0.05)的含量以及TNF-α的分泌量(p<0.05)。因此,一定濃度阿魏側(cè)耳胞外多糖對體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞具有激活作用。

胞外多糖,熒光探針,一氧化氮合成酶,白細胞介素-1,白細胞介素-12

多糖廣泛分布于動植物和微生物中,是自然界中含量最豐富的大分子化合物之一[1],根據(jù)在細胞中存在部位不同,多糖分為胞內(nèi)多糖、胞壁多糖和胞外多糖三種,與胞內(nèi)多糖不同,真菌胞外多糖易與菌體分離,可通過深層發(fā)酵獲得[2-3]。

阿魏側(cè)耳(Pleurotusferulaelanzi),是一種具有很高食藥用價值的擔子菌,具有抗腫瘤,提高免疫力[4-5]和延緩衰老等功效[6],阿魏側(cè)耳胞外多糖是從阿魏側(cè)耳液體發(fā)酵液中提取的多糖組分[3],目前對于阿魏側(cè)耳胞外多糖生物活性的研究局限在體內(nèi)研究階段[7],未有體外激活巨噬細胞及其機理的相關(guān)報道。本文利用建立的小鼠巨噬細胞體外培養(yǎng)體系,研究阿魏側(cè)耳胞外多糖對巨噬細胞吞噬和細胞因子分泌等免疫功能的影響作用,為其在食品、藥品中的進一步開發(fā)利用提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

阿魏側(cè)耳(PleurotusferulaeLanzi)胞外多糖實驗室制備[3];BALB/C小鼠動物許可證號:SCXK(京)2011-0011，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司;胎牛血清(FBS)上海生物工程有限公司;DMEM美國Gibco公司;脂多糖(LPS)美國Sigma公司;一氧化氮檢測試劑盒、一氧化氮DAF-FM DA探針碧云天生物技術(shù)有限公司;小鼠一氧化氮合成酶(NOS)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)和白細胞介素-12(IL-12)ELISA檢測試劑盒美國R&D公司;青霉素和鏈霉素山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;實驗中所用其他試劑均為分析純。

MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱日本SONYA公司;FD-1D-50真空冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;ZHJH-C超凈工作臺上海智城分析儀器制造有限公司;BX50系統(tǒng)(熒光)顯微鏡(配有DP71成像系統(tǒng))、CKX41SF倒置顯微鏡日本Olympus公司;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋日本SONYA公司;iMark酶標儀美國Bio-Rad公司;Milli-Q超純水機美國Millipore公司。VCX130超聲波細胞破碎儀美國Sonics公司。

1.2實驗方法

1.2.1多糖溶液的配制阿魏側(cè)耳胞外多糖用DMEM培養(yǎng)液溶解,0.22 μm針頭濾器過濾除菌后得濃度為2 g/L的阿魏側(cè)耳胞外多糖母液,冰箱中冷藏備用。

1.2.2小鼠巨噬細胞的獲得及多糖處理參考王晶等[7]方法。小鼠頸椎脫臼處死,75%酒精浸泡,注5 mL DMEM完全培養(yǎng)液(含10%體積分數(shù)的胎牛血清)至腹腔,靜置5 min,超凈工作臺中無菌打開腹腔,收集腹腔液,1500 r/min 離心10 min,棄上清,DMEM完全培養(yǎng)液重懸細胞并接種至培養(yǎng)皿中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗去未貼壁細胞,胰蛋白酶消化,收集細胞,1500 r/min 離心10 min,棄上清,DMEM完全培養(yǎng)液重懸后得純化的小鼠巨噬細胞懸液。臺盼藍染色后計數(shù),調(diào)整活細胞密度為5.0×105個/mL分別接種至培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)板中,多糖處理組添加2 g/L的阿魏側(cè)耳胞外多糖母液,終濃度分別為0、25、50、100、200 mg/L,陽性對照組添加終濃度為20 μg/mL的LPS,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3巨噬細胞吞噬能力檢測采用中性紅法[8]。按上述方法獲取、純化并接種巨噬細胞至96孔細胞培養(yǎng)板中,接種量為200 μL。每組設10個重復孔。培養(yǎng)板用PBS 漂洗3次后,每孔添加終濃度0.075%中性紅溶液(無菌PBS配制)100 μL,置37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h,吸棄上層溶液,PBS 漂洗后加入細胞裂解液(0.01 mol/L冰醋酸與無水乙醇混合液,體積比為1∶1)200 μL,4 ℃靜置過夜。酶標儀檢測490 nm處吸光值A490 nm。

1.2.4巨噬細胞NO含量測定NO的生成采用熒光探針法檢測[9]。按照上述方法獲取、純化并接種巨噬細胞至載玻片(置于培養(yǎng)皿中),待細胞貼壁后,添加足量DMEM(含10% FBS)培養(yǎng)液。每組設3個重復。多糖處理24 h后,收集培養(yǎng)上清,離心后冰箱冷藏備用。取出載玻片,細胞面朝上,添加稀釋好的DAF-FM DA探針,37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。PBS洗滌細胞三次,充分去除未進入細胞內(nèi)的DAF-FM DA探針,加蓋潔凈的蓋玻片后,熒光顯微鏡觀察拍照。

NO含量的測定采用Griess法[10]。依照試劑盒說明,酶標板分設為標準孔、空白孔和待測樣品孔,標準孔依次加濃度分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L標準品(NaNO2)溶液50 μL,空白孔加標準品稀釋液(DMEM完全培養(yǎng)液)50 μL,樣品孔加不同處理組巨噬細胞培養(yǎng)上清,各孔分別添加50 μL Griess Reagent Ⅰ及50 μL Griess Reagent Ⅱ。酶標儀檢測540 nm處吸光值A540 nm,根據(jù)濃度標準曲線計算樣品中NO濃度。

1.2.5一氧化氮合成酶(NOS)含量測定按上述方法獲取、純化和接種細胞至培養(yǎng)皿中,接種量為5 mL。多糖處理24 h后,細胞刮刀刮取細胞,離心,棄上清,磷酸緩沖溶液(PBS)重懸,超聲波細胞破碎儀破碎細胞(功率39 W;工作時間3 s,停止時間3 s,共50個循環(huán)),離心,收集上清,采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗[10]測定巨噬細胞內(nèi)NOS含量。

按照試劑盒說明,取出室溫平衡20 min后的板條,設置標準品孔、空白孔和樣品孔,標準品孔各加入不同濃度的標準品50 μL,樣品孔加待測樣品10 μL和40 μL樣品稀釋液,空白孔不加。除空白孔外,標準孔和樣品孔中每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL,37 ℃溫育30 min。棄去液體,吸水紙拍干,洗滌液洗滌5次,吸水紙拍干,每孔加入底物A、B各50 μL,37 ℃避光孵育15 min后每孔加入終止液50 μL,酶標儀檢測450 nm波長處各孔A450 nm,根據(jù)濃度標準曲線計算樣品中NOS濃度。

1.2.6TNF-α、IL-1和IL-12含量測定采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗[11]。取出多糖處理后的巨噬細胞培養(yǎng)上清,按照試劑盒說明操作(方法同1.2.5),根據(jù)濃度標準曲線計算TNF-α、IL-1和IL-12含量。

2　結(jié)果與分析

2.1阿魏側(cè)耳胞外多糖對小鼠巨噬細胞吞噬活性的影響

利用中性紅法檢測巨噬細胞吞噬功能,通過測定細胞內(nèi)中性紅的含量來反映巨噬細胞的吞噬能力。結(jié)果顯示(表1),培養(yǎng)體系中添加了阿魏側(cè)耳胞外多糖(25～200 mg/L)、LPS(20 mg/L)的巨噬細胞中,中性紅的含量顯著增加(p<0.05),表明,阿魏側(cè)耳胞外多糖對小鼠巨噬細胞的吞噬能力有增強作用。

表1　阿魏側(cè)耳胞外多糖對小鼠巨噬細胞吞噬活性的影響

注:“*”表示與空白對照組相比,差異顯著(p<0.05);表2、表3同。

2.2阿魏側(cè)耳胞外多糖對巨噬細胞NO和NOS含量的影響

巨噬細胞在免疫活化或外界信號刺激下,細胞內(nèi)可誘導型一氧化氮合成酶基因被誘導表達,催化精氨酸氧化成瓜氨酸并產(chǎn)生大量的NO[12]。DAF-FM DA是最新一代用于NO定量檢測的熒光探針[13],能夠進入細胞并被細胞內(nèi)酯酶催化形成不能穿過細胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身僅有很弱的熒光,但和細胞內(nèi)NO反應后可以產(chǎn)生強烈的熒光[14]。熒光結(jié)果顯示(圖1),對照組和添加25 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖組的巨噬細胞內(nèi)的熒光較弱,說明兩組巨噬細胞可能沒有產(chǎn)生NO,細胞內(nèi)的熒光是DAF-FM自發(fā)熒光。而添加50～200 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖、20 mg/L LPS的巨噬細胞內(nèi)綠色熒光的強度和平均光密度明顯增強(p<0.05)(見圖1C～F和圖2),表明,添加50～200 mg/L的阿魏側(cè)耳胞外多糖誘導巨噬細胞產(chǎn)生了NO。

圖1　NO熒光探針標記的小鼠巨噬細胞(200×)Fig.1　Murine macrophage stained by fluorescence probe for NO(200×)注:A,空白對照組;B～E,25、50、100、200 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖處理組;F,20 mg/L LPS處理組。

圖2　小鼠巨噬細胞中NO熒光探針的平均光密度值Fig.2　Mean optical density of fluorescence probe for NO in murine macrophage注:“*”,表示與對照組相比,差異顯著(p<0.05)。

表2　阿魏側(cè)耳胞外多糖對小鼠巨噬細胞胞外NO和NOS含量的影響

2.3阿魏側(cè)耳胞外多糖對巨噬細胞TNF-α、IL-1和IL-12分泌量的影響

表3　阿魏側(cè)耳胞外多糖對小鼠巨噬細胞多種細胞因子分泌量的影響

正常巨噬細胞(又稱為常駐巨噬細胞)處于相對靜止狀態(tài),很少甚至不分泌細胞因子,可在抗原刺激下發(fā)生活化,轉(zhuǎn)變成炎癥巨噬細胞,表現(xiàn)為對病原體和腫瘤細胞殺傷活性增強、分泌大量細胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-12)等生物活性的變化[16-18]。TNF-α是由巨噬細胞分泌產(chǎn)生的一種多效細胞因子,它具有殺傷或抑制腫瘤細胞、提高機體的免疫調(diào)節(jié)功能、提高中性粒細胞的吞噬活性以及抗感染等功效;IL-1主要由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生,可活化胸腺細胞和T細胞,促進B細胞增殖和抗體的分泌,調(diào)節(jié)機體免疫能力;IL-12 由B細胞和巨噬細胞等產(chǎn)生,具有激活NK細胞、刺激T細胞增殖等作用[19]。由表3可知,隨著阿魏側(cè)耳胞外多糖添加量的增加,TNF-α、IL-1、IL-12三種細胞因子的分泌量均呈上升趨勢。其中,添加量25～200 mg/L的胞外多糖可顯著提高小鼠巨噬細胞IL-1和IL-12的分泌量(p<0.05)。添加量50～200 mg/L的胞外多糖可顯著增加小鼠巨噬細胞TNF-α的分泌量(p<0.05)。表明,一定添加量的的阿魏側(cè)耳胞外多糖可活化小鼠巨噬細胞,誘導其產(chǎn)生更多的TNF-α、IL-1、IL-12等促炎細胞因子。

3　結(jié)論

本文采用原代培養(yǎng)技術(shù)獲得大量小鼠巨噬細胞,建立了其體外培養(yǎng)體系,并利用這一體系研究了阿魏側(cè)耳胞外多糖對體外培養(yǎng)的巨噬細胞的激活作用。根據(jù)中性紅實驗、Griess實驗和酶聯(lián)免疫吸附實驗,可知添加一定濃度的阿魏側(cè)耳胞外多糖可增強小鼠的吞噬能力,提高巨噬細胞NOS和NO的含量,增加免疫相關(guān)細胞因子TNF-α、IL-1和IL-12的分泌量。由此可見,從阿魏側(cè)耳液體發(fā)酵液中獲得的胞外多糖具有激活巨噬細胞并增強機體細胞免疫的功能,這為阿魏側(cè)耳液體發(fā)酵液的進一步開發(fā)利用具有一定的指導意義。

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Activation effects of extracellular polysaccharides produced byPleurotusferulaeLanzi on murine macrophage

WANG Jing1，2，3,ZHANG Chun-dan1,YANG Li-min1,XIE Chun-yan1，2，3, DU Juan1，2，3,YAN Xun-you1，2，3,WU Zhi-yan1，2，3，*

(1.College of Life Sciences,Langfang Teachers University,Langfang 065000,China; 2.Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities,Langfang 065000,China; 3.Edible Fungi Key Laboratory of Langfang City,Langfang 065000,China)

The culture system of macrophages was established to investigate the activation effects of extracellular polysaccharides produced byPleurotusferulaeLanzi(IPP)on murine macrophage. Murine macrophages were cultured in sterile environment. Phagocytic activity,the content of nitric oxide synthetase(NOS)and nitric oxide(NO),the levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-1(IL-1),and interleukin-12(IL-12)in culture supernatant were examined with neutral red phagocytosis test,fluorescein labeled probe technique,griess reaction and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),respectively. The results showed that IPP in the range of 25～200 mg/L reduced absorbance of neutral red in cytoplasm(p<0.05),improved the secretion level of IL-1(p<0.05)and IL-12(p<0.05)in culture supernatant. And IPP in the range of 50～200 mg/L increased the content of NOS(p<0.05)and NO(p<0.05),and the secretion level TNF-α(p<0.05). So murine macrophages culturedinvitrocould be activated by IPP at a certain concentration.

extracellular polysaccharides;fluorescein labeled probe;nitric oxide synthase;interleukin-1;interleukin-12

2015-10-09

王晶(1983-)，女，博士，講師，研究方向：動物細胞工程和生物活性物質(zhì)，E-mail:oucflora@163.com。

吳智艷(1962-)，女，教授，研究方向：食用菌栽培與深加工，E-mail:lfwuzhiyan@126.com。

河北省高等學?？茖W技術(shù)研究青年基金項目(QN2016019)；河北省高等學校科學研究計劃優(yōu)秀青年基金項目(YQ2013027)；河北省高校食藥用菌應用技術(shù)研發(fā)中心項目(YF201411-321)；河北省高等學校遺傳學重點發(fā)展學科項目(201221)；廊坊師范學院微生物學重點學科項目(201501)；廊坊師范學院大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(201510100036)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)10-0356-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.065