高產(chǎn)β-果糖基轉(zhuǎn)移酶的米曲霉菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

高　斌,梁　露,李　婭,李　斌,劉成梅,付桂明,*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; 2.南昌大學(xué)中德食品工程中心,江西南昌 330047; 3.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330031)

?

高產(chǎn)β-果糖基轉(zhuǎn)移酶的米曲霉菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

高斌1,2,3,梁露3,李婭3,李斌1,2,3,劉成梅1,2,3,付桂明1,2,3,*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; 2.南昌大學(xué)中德食品工程中心,江西南昌 330047; 3.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330031)

從本實(shí)驗(yàn)室保藏的6株米曲霉A-F01、A-F02、A-F03、A-F04、A-F05和 A-F06中,利用高效液相色譜HPLC-示差折光檢測(cè)器RID測(cè)定6株米曲霉生物合成β-果糖基轉(zhuǎn)移酶(β-FTase)酶活,篩選出高產(chǎn)β-果糖基轉(zhuǎn)移酶的米曲霉菌株A-F04,并通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)酶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示,影響發(fā)酵產(chǎn)酶因素的主次順序?yàn)榻臃N量、培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速;影響A-F04菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組成因素的主次順序?yàn)槭?、酵母粉、pH、硫酸銨;確定了A-F04菌株最佳產(chǎn)酶條件,即培養(yǎng)基組成為0.4%(m/v)的蔗糖、0.15%(m/v)的酵母粉、0.15%(m/v)的硫酸銨和0.2%(m/v)的氯化鈉,起始pH7.0,接種量為1.0%(v/v),培養(yǎng)時(shí)間為96 h,培養(yǎng)溫度為35 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min,其β-FTase酶活力可達(dá)519.65 U/g,相比在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基和初始條件下的酶活466.25 U/g,提高了11.45%。

β-果糖基轉(zhuǎn)移酶,米曲霉,高產(chǎn)菌株,條件優(yōu)化

β-果糖基轉(zhuǎn)移酶(β-fructosyltransferase,β-FTase,EC 2.4.1.9),能以蔗糖為反應(yīng)底物,生成β-D-果糖殘基和葡萄糖,β-D-果糖殘基通過β-1,2-糖苷鍵再連接蔗糖,最終生成低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)[1-3]。FOS包括蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)[4]。FOS對(duì)改善腸道功能、防治便秘和腹瀉、提高免疫力、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等具有特殊的生理功效[5-8],因此,FOS在醫(yī)藥、食品等開發(fā)應(yīng)用市場(chǎng)潛力巨大[9]。自然條件下,從植物中獲取FOS較為困難,且產(chǎn)量少,工業(yè)上主要用固定化酶β-FTase催化合成FOS[10-11]。研究表明,獲取大量β-FTase酶和選育β-FTase分泌高的安全菌株成為促進(jìn)FOS生產(chǎn)的關(guān)鍵之一。

楊正茂等[12]利用黑曲霉分泌表達(dá)β-FTase,然而黑曲霉一些次級(jí)代謝產(chǎn)物的食品安全性還存在爭(zhēng)議[13]。研究發(fā)現(xiàn),米曲霉(Aspergillusoryzae,A.oryzae)分泌和表達(dá)β-FTase能力較強(qiáng),且具有極高的食品安全性,被美國FDA 認(rèn)證為GRAS菌種之一[14-15]。對(duì)于利用米曲霉分泌表達(dá)β-FTase的研究近年來成為熱點(diǎn)。目前有關(guān)米曲霉生物合成β-FTase的相關(guān)報(bào)道中,蔣波[16]和何小妮等[17]選用酶活為105.09 U/g原始米曲霉菌株,分別通過紫外-氯化鋰復(fù)合誘變和利用非對(duì)稱滅活雙親原生質(zhì)體融合法選育產(chǎn)β-FTase的米曲霉新菌株,最終達(dá)到的酶活力分別為291.10 U/g和172.95 U/g。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室保藏的6株米曲霉A-F01、A-F02、A-F03、A-F04、A-F05和 A-F06為研究對(duì)象,6株初始菌株的酶活均較高,在6株米曲霉菌種進(jìn)一步對(duì)高產(chǎn)β-FTase米曲霉菌株進(jìn)行了篩選,并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究,以期獲得高產(chǎn)β-FTase的米曲霉菌株及其適宜的產(chǎn)酶條件,為工業(yè)化利用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)FOS提供一定的指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

6株米曲霉:AspergillusoryzaeA-F01、A-F02、A-F03、A-F04南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏;AspergillusoryzaeA-F05、A-F06江西中德聯(lián)合研究院；酵母粉阿拉丁試劑,BR純度;牛肉膏、蛋白胨北京奧博星,BR純度;玉米漿新沂恒惠淀粉糖有限公司;瓊脂粉上海山浦,BR純度;乙腈西隴化工,HPLC級(jí);低聚果糖日本W(wǎng)OKO,純度≥99.9%;葡萄糖、蔗糖和果糖Sigma試劑,純度≥99.0%;(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、NaOH、HCl、K2HPO4· 3H2O、磷酸氫二鈉、檸檬酸等國產(chǎn)分析純。

ZDX-35BI型座式蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;LGJ-1冷凍干燥機(jī)北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司;HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;LC-1260型高效液相色譜儀、示差折光檢測(cè)器美國安捷倫公司;TGL-16B型高速離心機(jī)美國熱電。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1生長曲線的建立采用菌絲體濕重法建立米曲霉的生長曲線。配制固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基于121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min,分裝試管冷卻后制成斜面?zhèn)溆?。用接種環(huán)接種6株米曲霉孢子,斜面劃線,30 ℃恒溫恒濕靜置培養(yǎng)3 d后,用滅菌生理鹽水洗脫斜面,制備米曲霉孢子懸浮液,孢子懸浮液倒入100 mL含有滅菌玻璃珠的三角瓶中,充分搖勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。分別以1%(v/v)的接種量接種6株米曲霉孢子懸浮液,30 ℃、150 r/min培養(yǎng)0～5 d。將培養(yǎng)時(shí)間為0、24、48、60、72、84、96、120 h的米曲霉菌絲體抽濾至恒重,收集菌絲體并稱重,確定生物量,菌絲體液氮研磨后凍干。

1.2.2粗酶液的制備稱取凍干后的6株各個(gè)不同培養(yǎng)時(shí)間段的米曲霉菌粉0.2 g,用5 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH6.0)重懸,10000 r/min 4 ℃離心10 min,吸取上層清液,過0.22 μm的水系滅菌微孔濾膜,收集濾液,即為粗酶液。

1.2.3酶活測(cè)定用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH6.0)配制25%的蔗糖溶液,分裝至100 mL錐形瓶中,于48 ℃預(yù)熱30 min,分別加入6株米曲霉粗酶液5 mL于錐形瓶中。將反應(yīng)體系置于恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱中,48 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)1 h,沸水浴15 min終止反應(yīng),離心取上清液制備樣品。酶活定義如下[18]:48 ℃條件下,每分鐘催化蔗糖產(chǎn)生1 μmol蔗果三糖GF2所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。每克菌粉酶活力H=(GF2×106)/(504.44×t×m),其中,GF2為蔗果三糖生成量,g;t為反應(yīng)時(shí)間,min;m為反應(yīng)菌粉質(zhì)量,g。

1.2.4HPLC檢測(cè)條件檢測(cè)器:安捷倫1260示差折光檢測(cè)器;色譜柱:Waters Spherisorb 5.0 μm NH2,4.6 mm×250 mm;流動(dòng)相:乙腈-水(80∶20,V/V),流速1.0 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。分別配制果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)液,分別單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣,確定6種糖類出峰時(shí)間。由于β-FTase在高濃度蔗糖下催化反應(yīng)主要生成蔗果三糖,因此僅對(duì)蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行繪制:精確配制100 mg/mL蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)液,超純水稀釋至0～100 mg/mL之間的不同濃度梯度的蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)液,HPLC示差折光檢測(cè)其峰面積,根據(jù)峰面積進(jìn)行定量。

1.2.5高產(chǎn)β-FTase菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.2.5.1菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化以高效液相HPLC酶活測(cè)定結(jié)果,確定高產(chǎn)β-FTase米曲霉菌株。

本研究以前期探究出的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(酵母粉1 g,(NH4)2SO42 g,蔗糖3 g,NaCl 2 g,蒸餾水定容至1 L,自然pH)為出發(fā),按照初始菌液0.5%、1.0%、2.0%、5.0%和10.0%的接種量在30 ℃,150 r/min發(fā)酵培養(yǎng)96 h,測(cè)定產(chǎn)β-FTase酶活,探究接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響;得到最佳接種量后,繼續(xù)探究菌體在25、30、35、37、40 ℃溫度下,按照最佳接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)96 h,測(cè)定其產(chǎn)β-FTase酶活大小,探究溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響;得到產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)溫度后,繼續(xù)探究菌體在100、125、150、175、200、250 r/min轉(zhuǎn)速下,在最佳接種量、最佳培養(yǎng)溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)96 h,探究轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響。

以接種量、溫度、轉(zhuǎn)速為因子,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,因素水平表見表1。在所得的最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),檢查結(jié)果的重現(xiàn)性。

表1　發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

圖1　6株菌不同發(fā)酵時(shí)間的β-FTase酶活和生物量Fig.1　β-FTase enzyme activity and biomass of 6 strains during different fermentation period

1.2.5.2菌株培養(yǎng)基的優(yōu)化以最佳發(fā)酵條件(最佳接種量、溫度和轉(zhuǎn)速)為基礎(chǔ),探究四種不同的0.3%(m/v)碳源(淀粉、蔗糖、果糖和葡萄糖)對(duì)產(chǎn)酶的影響,并以此出發(fā)探究產(chǎn)酶最高的碳源濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.5%、0.8%、1.0%時(shí)對(duì)產(chǎn)酶的影響;以最佳發(fā)酵條件和最佳濃度的碳源為不變因素,探究四種不同的0.1%(m/v)的有機(jī)氮源(蛋白胨、酵母粉、玉米漿和牛肉膏)對(duì)產(chǎn)酶的影響,并以此出發(fā)探究最佳有機(jī)氮源濃度為0.05%、0.08%、0.10%、0.15%、0.20%時(shí)對(duì)產(chǎn)酶的影響;以最佳發(fā)酵條件、最佳濃度的碳源和最佳濃度的有機(jī)氮源為不變因素,探究四種不同的0.2%(m/v)的無機(jī)氮源(氯化銨、硫酸銨、硝酸銨和硝酸鈉)對(duì)產(chǎn)酶的影響,并以此出發(fā)探究最佳無機(jī)氮源濃度為0.1%、0.15%、0.20%、0.25%時(shí)對(duì)產(chǎn)酶的影響;以最佳發(fā)酵條件、最佳濃度的碳源、最佳濃度的有機(jī)氮源和無機(jī)氮源為不變因素,探究不同起始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)的培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)酶的影響。

以碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源和pH為因子,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化,因素水平見表2。在所得的最佳發(fā)酵條件和培養(yǎng)基下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),檢查結(jié)果的重現(xiàn)性。

表2　培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3數(shù)據(jù)分析

本文中菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化、高效液相測(cè)定菌株酶活等所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,采用Origin 9.1和SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,樣品平均值之間的差異性通過Duncan法比較(p<0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.16株米曲霉菌株產(chǎn)β-FTase能力分析

2.1.1蔗果三糖標(biāo)曲的繪制在高濃度的蔗糖反應(yīng)液中,β-FTase催化蔗糖主要生成蔗果三糖,因此測(cè)定蔗果三糖濃度即可反映β-FTase催化能力。以蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)品含量(x)為橫坐標(biāo),該檢測(cè)條件下信號(hào)的峰面積(y)作為縱坐標(biāo),得到的回歸線性方程為y=103143x-24416,R2=0.9994,在其濃度為0～60 mg/mL內(nèi),蔗果三糖濃度與信號(hào)峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2米曲霉生長曲線和產(chǎn)酶曲線抽濾米曲霉發(fā)酵菌球,獲取菌絲體濕重。測(cè)定6株米曲霉在不同時(shí)間段(0、24、48、60、72、84、96和120 h)的酶活大小(三組平行樣),結(jié)果(圖1)可知,6株米曲霉在發(fā)酵時(shí)間為96 h時(shí),生物量和酶活均最大,其中菌株A-F04生物達(dá)到(6.04±0.03)g,且6株菌均在對(duì)數(shù)生長期時(shí)酶活增加最快,在穩(wěn)定期時(shí)酶活最高,趨于穩(wěn)定。因此,選擇發(fā)酵96 h的6株米曲霉作為酶活對(duì)比的時(shí)間點(diǎn)。

2.1.3高產(chǎn)β-FTase的米曲霉菌株的篩選利用HPLC-RID測(cè)定6株米曲霉發(fā)酵96 h的菌絲體酶活,計(jì)算GF2的量和酶活大小,結(jié)果見圖2?？芍浊笰-F04生成的GF2量為28.22 mg/mL,具有最高的酶活466.25 U/g。根據(jù)6株米曲霉在同等條件下的生物量和酶活測(cè)定結(jié)果,可知菌株A-F04是高產(chǎn)β-FTase菌株,因此選擇米曲霉菌株A-F04為基礎(chǔ),進(jìn)一步對(duì)其產(chǎn)酶條件研究。

2.2高產(chǎn)β-FTase米曲霉菌株A-F04產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.2.1米曲霉A-F04發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1.1不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖3。分析結(jié)果可知,1.0%的接種量對(duì)應(yīng)的酶活最高,為284.77 U/g;接種量從0.5%增加到1.0%時(shí),酶活呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì),說明一定程度上,增加接種量可以提高酶的表達(dá);而當(dāng)接種量從1.0%增加到10.0%時(shí),酶活呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),說明接種量增加到一定程度反而不利于酶的表達(dá)。結(jié)果表明接種量過大或者過小都會(huì)影響酶活大小,其可能原因是接種量過大,營養(yǎng)供應(yīng)不足;接種量過小,總菌體增長較慢從而使分泌的酶的酶活降低。

圖3　接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3　β-FTase enzyme activity in different inoculum concentration

2.2.1.2不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖4。分析結(jié)果可知,35 ℃條件下對(duì)應(yīng)的酶活最高,為312.54 U/g;當(dāng)溫度從25 ℃增加到35 ℃時(shí),酶活呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),說明一定程度上,提高培養(yǎng)溫度可以提高酶的表達(dá);而當(dāng)溫度大于35 ℃時(shí),酶活呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),說明溫度過高不利于酶的表達(dá)。結(jié)果表明溫度過高或者過低都會(huì)影響酶活,其原因是菌體需要在最適溫度下,產(chǎn)酶能力相對(duì)較高。

圖4　溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4　β-FTase enzyme activity in different temperature

2.2.1.3不同轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響不同轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖5。分析結(jié)果可知,轉(zhuǎn)速為200 r/min對(duì)應(yīng)的酶活最高,為390.65 U/g;當(dāng)轉(zhuǎn)速從100 r/min增加到200 r/min時(shí),酶活呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì),說明一定程度上,提高轉(zhuǎn)速可以提高酶的表達(dá);而當(dāng)轉(zhuǎn)速大于200 r/min時(shí),酶活呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),說明轉(zhuǎn)速過快不利于酶的表達(dá)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)速過大或者過小對(duì)產(chǎn)酶都有影響,其原因是菌體屬于好氧菌,生長需要適宜的O2濃度,轉(zhuǎn)速會(huì)影響O2濃度大小。

圖5　轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5　β-FTase enzyme activity in different rotation rate

2.2.1.4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3,方差分析結(jié)果見表4。

表3　發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4　發(fā)酵條件的方差分析

由表3和表4可知RA>RB>RC,即影響米曲霉A-F04菌株產(chǎn)β-FTase的主次順序?yàn)?接種量>培養(yǎng)溫度>轉(zhuǎn)速。根據(jù)各因素不同水平的K值大小,可知米曲霉A-F04產(chǎn)β-FTase的發(fā)酵條件優(yōu)組合為A2B2C3,即培養(yǎng)時(shí)間為96 h,接種量為1%,培養(yǎng)溫度為35 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min。表4方差分析表明3個(gè)因子的影響均不顯著。對(duì)正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件組合進(jìn)行3批次產(chǎn)酶培養(yǎng)驗(yàn)證,菌體的酶活分別為(495.47±3.87)、(496.11±1.68)、(494.28±3.66) U/g,平均值為495.29 U/g,實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的重現(xiàn)性。

2.2.2米曲霉A-F04發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.2.1碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在最佳發(fā)酵條件下,培養(yǎng)基中的不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖6-A。圖6-A結(jié)果表明,蔗糖為碳源時(shí),酶活最高,達(dá)到469.87 U/g,可能原因是蔗糖對(duì)β-FTase酶的產(chǎn)生有一定的誘導(dǎo)效果,故確立蔗糖最佳碳源。探究了不同濃度的蔗糖對(duì)產(chǎn)酶的影響,其酶活測(cè)定結(jié)果見圖6-B,可知蔗糖濃度為0.4%時(shí),酶活最高,達(dá)到496.87 U/g。

圖6　最佳碳源和蔗糖濃度對(duì)產(chǎn)酶的探究Fig.6　β-FTase enzyme activity in different carbon source and sucrose concentration

2.2.2.2氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在最佳發(fā)酵條件下,培養(yǎng)基中不同的有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖7-A。圖7-A表明,酵母粉為有機(jī)氮源時(shí),酶活最高。故確立酵母粉為最佳有機(jī)氮源。以此出發(fā),探究酵母粉不同濃度。由圖7-B可知酵母粉濃度為0.15%時(shí),酶活最高,達(dá)到512.7 U/g。

圖7　最佳有機(jī)氮源和酵母粉濃度對(duì)產(chǎn)酶的探究Fig.7　β-FTase enzyme activity in different organic nitrogen source and yeast extract concentration

在最佳發(fā)酵條件下,培養(yǎng)基中不同的無機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖8。圖8-A表明,硫酸銨為無機(jī)氮源時(shí),酶活最高。故確定硫酸銨為最佳無機(jī)氮源。以此出發(fā),探究不同濃度的硫酸銨對(duì)產(chǎn)酶的影響,酶活測(cè)定結(jié)果見圖8-B,可知硫酸銨濃度為0.15%時(shí),酶活最高。

圖8　最佳無機(jī)氮源和硫酸銨濃度對(duì)產(chǎn)酶的探究Fig.8　β-FTase enzyme activity in different inorganic nitrogen source and ammonia sulfate concentration

2.2.2.3起始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在最佳發(fā)酵條件下,培養(yǎng)基中的不同起始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖9,分析結(jié)果可知,培養(yǎng)基起始pH過高或過低都會(huì)對(duì)酶活會(huì)產(chǎn)生影響,pH為7.0時(shí),產(chǎn)酶效果最好,酶活達(dá)到519.65 U/g。

圖9　不同起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9　β-FTase enzyme activity in different initial pH

2.2.2.4優(yōu)化培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5,方差分析見表6。

由表5可知,各因素影響米曲霉A-F04菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的主次順序?yàn)?A>B>D>C。由表6可知ABDC四因素對(duì)菌株A-F04產(chǎn)酶影響不顯著。因此,米曲霉A-F04菌株產(chǎn)β-FTase的最佳培養(yǎng)基組成為A2B2D2C1,即0.4%的蔗糖為碳源,0.15%的酵母粉為有機(jī)氮源,培養(yǎng)起始pH為7.0,0.15%的硫酸銨為無機(jī)氮源。對(duì)正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組合進(jìn)行3批次產(chǎn)酶培養(yǎng)驗(yàn)證,酶活分別為(514.17±3.17)、(516.78±3.66)、(517.02±1.29)U/g,平均值為515.99 U/g,實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的重現(xiàn)性。

表5　培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6　培養(yǎng)基的方差分析

3　結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn),鑒定出了6株米曲霉都具有產(chǎn)β-FTase能力,且篩選出了米曲霉A-F04為高產(chǎn)β-FTase菌株,確定了米曲霉A-F04產(chǎn)β-FTase的最佳產(chǎn)酶條件,即在0.4%的蔗糖為碳源,0.15%的酵母粉為有機(jī)氮源,培養(yǎng)起始pH為7.0,0.15%的硫酸銨為無機(jī)氮源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為1.0%,培養(yǎng)時(shí)間為96 h,培養(yǎng)溫度為35 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min,具有較高的酶活力519.65 U/g,相比在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基和初始條件下的酶活466.25 U/g,提高了11.45%。同時(shí)測(cè)定了該條件的菌絲體濕重達(dá)到(6.04±0.03)g,說明米曲霉A-F04菌株在此條件下不僅生物量較高,而且具有較高的產(chǎn)酶能力。本研究結(jié)果表明,米曲霉A-F04是一株具有進(jìn)一步改造利用價(jià)值的產(chǎn)β-FTase的米曲霉菌株,但所產(chǎn)β-FTase的酶學(xué)性質(zhì)以及能否理想擴(kuò)大至工業(yè)上生產(chǎn)應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

[1]毛多斌,王雪. 果糖基轉(zhuǎn)移酶及低聚果糖生產(chǎn)研究進(jìn)展[J]. 廣東化工,2009,36(4):100-102.

[2]Chiang C J,Lee W C,Sheu D C,et al. Immobilization ofβ-Fructofuranosidases from Aspergillus on Methacrylamide-Based Polymeric Beads for Production of Fructooligosaccharides[J]. Biotechnology Progress,1997,13(5):577-582.

[3]覃益民,唐江濤,蘇加坤,等. 米曲霉 GX0011β-果糖基轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)研究[J]. 食品工業(yè)科技,2007,28(5):123-126.

[4]Ruekjumnong R,Ngampanya B,Khuwijitjaru P,et al. Functional prebiotic activity of inulin and fructooligosaccharides[J]. Journal of Food Science and Agricultural Technology(JFAT),2015,1(1):149-151.

[5]OHTA A,OHTUKI M,TAKIZAWA T,et al. Effects of fructooligosaccharides on the absorption of magnesium and calcium by cecectomized rats[J]. International Journal for Vitamin and Nutrition Research,1994,64(4):316-323.

[6]Molis C H,Flourie B,Ouarne F,et al. Digestion,excretion,and energy value of fructooligosaccharides in healthy humans[J]. The American Journal of Clinical Nutrition,1996,64(3):324-328.

[7]Costa G T,Abreu G C,Guimar?es A B B,et al. Fructo-oligosaccharide effects on serum cholesterol levels. An overview[J]. Acta Cirurgica Brasileira,2015,30(5):366-370.

[8]Vega R,Zuniga-Hansen M E. The effect of processing conditions on the stability of fructooligosaccharides in acidic food products[J]. Food Chemistry,2015,173:784-789.

[9]Spiegel J E,Rose R,Karabell P,et al. Safety and benefits of fructooligosaccharides as food ingredients[J]. Food Technology,1994,48(1):85-89.

[10]Lorenzoni A S G,Aydos L F,Klein M P,et al. Continuous production of fructooligosaccharides and invert sugar by chitosan immobilized enzymes:comparison between in fluidized and packed bed reactors[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2015,111:51-55.

[11]Mouelhi R,Abidi F,Marzouki M N. An improved method for production of fructooligosaccharides by immobilizedβ-fructofuranosidase from Sclerotinia sclerotiorum[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry,2015,28(6),38-42.

[12]楊正茂,秦克亮.β-果糖基轉(zhuǎn)移酶和β-呋喃果糖苷酶的分離純化[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2002,33(5):219-223.

[13]梁志宏,黃昆侖,何云龍,等. 黑曲霉及其食品安全領(lǐng)域的赭曲霉毒素問題[J]. 食品科技,2008,33(10):191-194.

[14]Kobayashi T,Abe K,Asai K,et al. Genomics of Aspergillus oryzae[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2007,71(3):646.

[15]劉麗萍,劉麗華. 米曲霉研究進(jìn)展與應(yīng)用[J]. 中國調(diào)味品,2008(4):28-32.

[16]蔣波.高活力果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌種選育及生產(chǎn)工藝優(yōu)化研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2014.

[17]何小妮,蔣波,王玉海,等. 非對(duì)稱滅活雙親原生質(zhì)體融合法選育產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的米曲霉新菌株的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2013,29(5):993-997.

[18]李秀英,黃金鳳,冼燕萍,等. 食品中低聚果糖的檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2014,37(3):32.

Screening and identification of efficientβ-fructosyltransferase-producingAspergillusoryzaeand optimization of the fermentation condition

GAO Bin1,2,3,LIANG Lu3,LI Ya3,LI Bin1,2,3,LIU Cheng-mei1,2,3,FU Gui-ming1,2,3,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China; 2.Sino-German Food Engineering Center,Nanchang University,Nanchang 330047,China；3.Food Science and Technology College,Nanchang University,Nanchang 330031,China)

6β-fructosyltransferase-producingAspergillusoryzaestrains were activated and cultured at shake flask fermentation. In this study,high efficiency liquid chromatography technology was applied to gauging the enzyme activity ofβ-fructosyltransferase,and the enzyme activity ofβ-fructosyltransferase produced by 6 differentAspergillusoryzaestrains were contrasted,in order to screening the efficientβ-fructosyltransferase-producingAspergillusoryzaestrains. Thus,experiments of single factor and orthogonal tests were done to optimize the fermentation condition. Experimental results showed that the influencing factors of fermentation were temperature,inoculum concentration,rotation rate,sucrose concentration,yeast extract concentration,initial pH and ammonia sulfate concentration. The optimum condition for higherβ-fructosyltransferase were determined:cultured in the medium of 0.4%(m/v)sucrose,0.15%(m/v)yeast extract,0.2%(m/v)NaCl,0.15%(m/v)ammonia sulfate,initial pH7.0,inoculum concentration 1.0% under 35 ℃,200 r/min in shake cultures for 96 h. Maximalβ-fructosyltransferase activity of A-F04 was 519.65 U/g,increasing 11.45% enzyme activity compared with the original fermentation condition(466.25 U/g).

β-fructosyltransferase;Aspergillusoryzae;efficient expressing strain;optimizing

2015-10-26

高斌(1991-),男,碩士研究生,研究方向:發(fā)酵工程,E-mail:820839790@qq.com。

付桂明(1972-),男,博士,教授,研究方向:天然產(chǎn)物、發(fā)酵食品研究,E-mail:fuguiming@ncu.edu.cn。

食品與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題(SKLF-22B-201313)。

TS203.1

A

1002-0306(2016)10-0224-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.037