羅非魚下腳料酶解液特定腐敗菌的分離和鑒定

沈志華,崔　春,潘子強(qiáng)

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.電子科技大學(xué)中山學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣東中山 528400)

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羅非魚下腳料酶解液特定腐敗菌的分離和鑒定

沈志華1,2,崔春1,*,潘子強(qiáng)2

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.電子科技大學(xué)中山學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣東中山 528400)

采用PCR-DGGE和PCR-RFLP技術(shù)研究了羅非魚下腳料酶解液冷藏過程中的特定腐敗菌。結(jié)果表明:酶解液在冷藏條件下,在20 d左右腐敗,細(xì)菌總數(shù)在0～12 d里逐漸增加(8.71×102～8.13×107cfu/g),12 d之后趨向穩(wěn)定。16S rRNA的PCR-RFLP及序列比對分析結(jié)果顯示,隨機(jī)挑取的18株細(xì)菌分成三個(gè)分型,其中分型1占61%,與Genbank核酸數(shù)據(jù)庫的假單胞菌(Pseudomonassp.)有最大相似性;PCR-DGGE圖譜顯示酶解液的細(xì)菌菌相隨時(shí)間的延長而逐漸減少,腐敗終點(diǎn)菌相單一。DGGE主要條帶測序結(jié)果表明,酶解液存在三個(gè)類群的細(xì)菌,分別是假單胞菌屬、氣單胞菌屬(Aeromonas)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),其中在酶解液腐敗終點(diǎn),熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)占絕對優(yōu)勢,與RFLP結(jié)果相符。

羅非魚下腳料,酶解液,特定腐敗菌,RFLP,PCR-DGGE

水產(chǎn)品加工過程中所使用的原料、加工方法和產(chǎn)品的貯藏條件不同的差異會(huì)導(dǎo)致殘存不同的腐敗細(xì)菌,產(chǎn)生不同的腐敗類型。據(jù)報(bào)道,未冷藏鮮魚的特定腐敗菌(Specific Spoilage Organism,SSO)為弧菌科(Vibrionaceae)等革蘭氏陰性細(xì)菌,而冷藏后優(yōu)勢腐敗菌則變?yōu)楦锾m氏陰性嗜冷菌或腸細(xì)菌(Enterobactericeae)[1],其中熱帶淡水魚的SSO多為假單胞菌,海洋溫帶水域魚的SSO多為腐敗希瓦氏菌[2]。冷藏貝類和甲殼類的SSO多為假單胞菌(Pseudomonassp.)或者腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)[3]。而經(jīng)過真空或氣調(diào)包裝冷藏后水產(chǎn)品的SSO多為磷發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)、乳酸菌(Lactobacillus)和熱殺索氏菌(Brochothrixthermosphacta)[1]。許鐘等報(bào)道,冷藏養(yǎng)殖羅非魚、大黃魚、三文魚片等貨架期終點(diǎn)的特定腐敗菌為假單胞菌[4-8]。徐麗敏等[9]發(fā)現(xiàn)4 ℃冷藏南美白對蝦的優(yōu)勢腐敗菌是假單胞菌與氣單胞菌(Aeromonassp.)。

在加工后的水產(chǎn)品中,特定腐敗菌為乳酸菌如乳桿菌(Lactobacillus)、肉食桿菌(Carnobacillus),以及發(fā)酵型革蘭氏陰性細(xì)菌如磷發(fā)光桿菌、適冷的腸桿菌等居多。在半保藏產(chǎn)品如醋漬魚或暴腌魚中,乳酸菌和酵母菌居多。輕度加熱處理制作的真空蒸煮袋產(chǎn)品在貯藏中,芽袍桿菌屬(Bacilus)或梭菌屬芽抱桿菌(Clostridium)多為優(yōu)勢腐敗菌[10]。許鐘等[11]報(bào)道淡腌大黃魚5 ℃保藏,缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminute),10 ℃和15 ℃貯藏時(shí),微小球菌(Micrococcusrose)為優(yōu)勢腐敗菌。

目前,以羅非魚下腳料為原料,通過控制酶解制備呈味基料、功能性肽和改性蛋白已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[12-13]。但是酶解液的保鮮防腐、酶解液的菌相及特定腐敗菌的研究鮮有報(bào)道,研究和了解不同加工條件及貯藏條件下的酶解液的菌相及腐敗菌,可為蛋白水解物的保存和防腐提供理論依據(jù)。因此本實(shí)驗(yàn)采用PCR-DGGE和PCR-RFLP技術(shù)研究冷藏條件下羅非魚下腳料酶解液的特定腐敗菌可為其保鮮技術(shù)提供研究基礎(chǔ),為優(yōu)化羅非魚下腳料酶解液冷藏鏈技術(shù)參數(shù)和快速預(yù)測產(chǎn)品品質(zhì)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅非魚購于中山市厚興市場;Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、100 bp和500 bp DNA Ladder Marker、MspⅠ限制性內(nèi)切酶(10 U/μL)、27F和1492R引物大連寶生物工程有限公司;瓊脂糖、PCA培養(yǎng)基、EDTA、Tris北京鼎國生物技術(shù)有限公司;E.Z.N.A. Cycle-Pure kitOmega Bio-tek,USA;胰蛋白酶(2×105U/g)、Flavourzyme500MG風(fēng)味蛋白酶(5×104U/g)諾維信。

LRH-250-GB型培養(yǎng)箱韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司;TD5A-WS型離心機(jī)湖南賽特湘儀公司;T100型PCR儀、DCode型突變檢測系統(tǒng)美國BIO-RAD公司;DYY-6C電泳儀及DYCP-31DN型水平電泳槽北京六一儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1材料及樣品前處理方法羅非魚新鮮宰殺后取魚頭、魚骨、魚尾下腳料搗碎后,料液比1∶2,pH7.5,于50 ℃的恒溫水浴鍋中,先加入胰蛋白酶水解2 h后再加入風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)酶解2 h(酶用量均為700 U/g原料),然后于90 ℃水浴滅酶10 min,冷卻后,8000 r/min離心15 min,去除上層油脂與下層殘?jiān)?取中間層酶解液備用[14]。

1.2.2微生物培養(yǎng)及細(xì)菌生長總數(shù)變化分別取0、2、4、6、8、12、16、20 d的樣品,將含菌體的樣液低速離心,除去固體雜質(zhì)后取中間清液在PCA培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋涂布,倒置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h,然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

將冷藏20 d(腐敗終點(diǎn))的酶解液按上述方法培養(yǎng)細(xì)菌,挑選出形態(tài)色澤一致且占優(yōu)勢的菌株分離純化后,保存于甘油中備用。

1.2.3DNA的提取細(xì)菌DNA的粗提:取各菌種的細(xì)菌培養(yǎng)液1 mL于離心管中進(jìn)行高速離心(轉(zhuǎn)速12000 r/min)5 min,棄上清液,在離心管中加入100 μL無菌水,振蕩成懸液。將離心管置于100 ℃沸水浴中反應(yīng)10 min后,再于冰浴中冷卻2 min。最后進(jìn)行高速離心(轉(zhuǎn)速12000 r/min)5 min,取上清液作細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增的模板。

酶解液細(xì)菌總DNA的提取:操作方案參照江蕓[15]文獻(xiàn)完成,該DNA將用于PCR-DGGE技術(shù)分析。

1.2.4限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)分析以1.2.3中獲得的細(xì)菌DNA的粗提液作模板,利用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rRNA基因。上游引物27F:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′,下游引物1492R:5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。50 μL的PCR反應(yīng)體系成分參照潘子強(qiáng)文獻(xiàn)[16]操作。

PCR反應(yīng)條件:94 ℃,5 min;94 ℃,45 s;53 ℃,45 s;72 ℃,1.5 min;循環(huán)30次;最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物直接用5 U MspⅠ限制性內(nèi)切酶消化,反應(yīng)條件為37 ℃恒溫水浴6 h。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳來分析酶切圖譜。

1.2.5PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)分析把1.2.3中獲得的DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。用細(xì)菌通用引物B338f和B518r擴(kuò)增酶解液中腐敗菌的16S rRNA V3可變區(qū)。引物B338f帶GC夾:5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′,5′GC夾:5′CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G,引物B518r:5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′,PCR反應(yīng)體系及條件同1.2.4中。

配制凝膠:按照DGGE說明書組裝梯度制膠器。PCR結(jié)束后,取出PCR產(chǎn)物,用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。

電泳:預(yù)電泳電壓20 V,時(shí)間30 min。正式電泳電壓70 V,時(shí)間16～18 h。

染色:加入250 mL固定液中,放置在搖床上搖蕩,脫色15 min。倒掉固定液,用去離子水沖洗2次,倒掉后加入250 mL銀染液中,放置在搖床上搖蕩,染色15 min。倒掉銀染液,用去離子水沖洗2次,倒掉后加入250 mL顯色液,待條帶出現(xiàn)后停止顯色。倒掉顯色液,用去離子水沖洗2次,加固定液終止5 min。倒掉固定液,用去離子水沖洗2次。

1.2.6PCR產(chǎn)物純化、測序及序列分析采用E.Z.N.A. Cycle-Pure kit(Omega Bio-tek,USA)純化DGGE主要條帶的PCR產(chǎn)物和RFLP不同分型的16S rRNA PCR產(chǎn)物。純化產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序,測序結(jié)果用Vector NTI Advance 11.0中的ContigExpress拼接,去掉兩端質(zhì)量低于40 bp的序列,將得到的16S rDNA序列用blastn比對NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫。

表1　各分型16S rDNA序列比對分析結(jié)果

2　結(jié)果與分析

2.1酶解液細(xì)菌生長總數(shù)變化

實(shí)驗(yàn)樣品腐敗時(shí)間共20 d,在第20 d,酶解液呈黃色且表面發(fā)粘,并發(fā)出惡臭味。通過氣味、顏色和粘稠度可基本判斷酶解液已經(jīng)腐敗。

細(xì)菌生長總數(shù)變化如圖1所示。酶解液初始帶菌量為8.71×102cfu/g,細(xì)菌總數(shù)變化隨著冷藏時(shí)間延長逐漸增加,在第12 d細(xì)菌總數(shù)達(dá)到8.13×107cfu/g,隨后在12～20 d細(xì)菌總數(shù)趨向穩(wěn)定,在8.13×107～9.77×107cfu/g之間。參照國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(International Commission of Microbiological Specializations on Food,ICMSF)的水產(chǎn)品貨架期終點(diǎn)細(xì)菌總數(shù)參考值(7.0×107cfu/g),本實(shí)驗(yàn)在第8 d即達(dá)到7.0×107cfu/g,但此時(shí)的酶解液在氣味、顏色和質(zhì)感還沒有達(dá)到感官評(píng)價(jià)的腐敗現(xiàn)象,直到第20 d才達(dá)到ICMSF標(biāo)準(zhǔn)的參考水平。因此我們根據(jù)ICMSF的標(biāo)準(zhǔn)及感官評(píng)價(jià)確定在4 ℃冷藏條件下,酶解液在第20 d時(shí)腐敗。

圖1　羅非魚下腳料酶解液在4 ℃冷藏過程中細(xì)菌生長總數(shù)變化Fig.1　The number of bacteria from Tilapia wastes enzymatic hydrolysates storaged at 4 ℃

2.2特定腐敗菌的16S rDNA RFLP分析

冷藏的第20 d,將酶解液勻漿液梯度稀釋后涂布在PCA平板培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜后,隨機(jī)從平板上挑選18株細(xì)菌,經(jīng)微生物方法分離純化得到純種后,提取細(xì)菌DNA,利用通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其PCR產(chǎn)物用Msp I酶切,進(jìn)行RFLP分析。RFLP結(jié)果(圖2)顯示18株細(xì)菌的16S rDNA被分成3種RFLP分型,編號(hào)1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17作為分型1,共11個(gè),占總數(shù)的61%;編號(hào)2、12、15、16作為分型2,共4個(gè),占總數(shù)的22%;編號(hào)13、14、18作為分型3,共3個(gè),占總數(shù)的17%。結(jié)果表明分型1的細(xì)菌是酶解液在4 ℃冷藏條件下的優(yōu)勢菌。

圖2　酶解液的16S rDNA基因Msp I酶切圖譜Fig.2　Profiles of 16S rDNA gene enzymed by Msp I

2.3RFLP序列分析

將RFLP不同分型的菌株的16S rDNA序列用blast比對NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫,結(jié)果見表1。

從表1中可以看出,分型1的細(xì)菌與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescensstrain Y1)有最大的相似性,分型2的細(xì)菌與氣單胞菌屬的Aeromonassp. REm-amp_42、Aeromonasveroniistrain A7、Aeromonasallosaccharophilastrain S5-33有最大的相似性,而分型3的細(xì)菌則與芽孢桿菌Bacillussp. TF1-3有最大的相似性。已有研究表明,假單胞菌、氣單胞菌及芽孢桿菌都是可以作為潛在的腐敗菌。因此,這三種菌是酶解液在冷藏條件下的腐敗菌,而占總體61%的分型1則是在這種條件下的優(yōu)勢菌,即特定腐敗菌。

2.4酶解液中細(xì)菌的DGGE圖譜分析及主要條帶測序分析

DGGE電泳圖譜上不同條帶代表不同的細(xì)菌,條帶顏色越重反映細(xì)菌的數(shù)量越多。從圖3中可以看出,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長,細(xì)菌菌相也不斷變化,條帶b出現(xiàn)在第2 d。條帶c在第2 d被微弱檢出,到第4 d為主要優(yōu)勢菌,然后隨冷藏時(shí)間的增加而逐漸減弱。條帶f從第16～20 d菌相變得單一,且顏色變得非常濃,明顯處于優(yōu)勢地位,但是在第16 d之前條帶f都是處于劣勢地位的,說明條帶f所代表的菌種是酶解液在冷藏條件下的特定腐敗菌。

從DGGE凝膠上切下5個(gè)主要條帶,經(jīng)過重新PCR及DGGE的確定、測序,5個(gè)條帶的序列經(jīng)Genbank比對后的結(jié)果列于表2。

表2　DGGE主要條帶序列比對分析結(jié)果

圖3　酶解液在4 ℃冷藏過程中細(xì)菌的DGGE圖譜Fig.3　The DGGE profiles of bateria from enzymatic hydrolysates storaged at 4 ℃注:a～f表示條帶位置。

從表2比對的結(jié)果看,酶解液存在三個(gè)類群的細(xì)菌,分別是假單胞菌屬(d、f條帶)、氣單胞菌屬(a和c條帶)和不動(dòng)桿菌屬(b條帶),其中f條帶熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)在酶解液腐敗終點(diǎn)占絕對優(yōu)勢,而這個(gè)菌常常是多種水產(chǎn)品的特定腐敗菌。這與前面RFLP分析結(jié)果是相符的。

3　結(jié)論

運(yùn)用PCR-DGGE和RFLP分析技術(shù)對羅非魚下腳料酶解液特定腐敗菌進(jìn)行了分析鑒定。結(jié)果顯示:酶解液在20 d腐敗。在RFLP分析中,發(fā)現(xiàn)酶解液在4 ℃冷藏條件下的腐敗菌有3種,其中分型1有11個(gè),占總數(shù)的61%,分型2有4個(gè),占總數(shù)的22%,分型3有3個(gè)占總數(shù)的17%,表明分型1的細(xì)菌是酶解液4 ℃冷藏下的優(yōu)勢腐敗菌。測序及序列比對分析顯示分型1、2、3分別與假單胞菌(Pseudomonassp.)、氣單胞菌(Aeromonassp.)和芽孢桿菌(Bacillussp.)的序列有最大的相似性。DGGE主要條帶測序結(jié)果表明,酶解液存在三個(gè)類群的細(xì)菌,分別是假單胞菌屬、氣單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),其中在酶解液腐敗終點(diǎn),熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)占絕對優(yōu)勢。假單胞菌屬是一類好氧且適應(yīng)能力極強(qiáng)的革蘭氏陰性致腐菌,生長率相對于其他菌有明顯的優(yōu)勢,在有氧條件下分解蛋白質(zhì)的能力極強(qiáng),是水產(chǎn)加工產(chǎn)品類的特定腐敗微生物。

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Isolation and identification of specific spoilage organism from Tilapia wastes enzymatic hydrolysates

SHEN Zhi-hua1,2,CUI Chun1,*,PAN Zi-qiang2

(1.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.Zhongshan Institute,University of Electronic Science and Technology,Zhongshan 528400,China)

Specific spoilage organism of Tilapia Wastes enzymatic hydrolysates during chilled storage was studied by PCR-DGGE and PCR-RFLP. Results indicated that Tilapia enzymatic hydrolysates spoilaged about 20 days at 4 ℃,and the total number of bacteria increased during 0～12 days(8.71×102～8.13×107cfu/g)gradually,became stable during 12～20 days. There were three types of bacteria by PCR-RFLP analysis of 16S rRNA from 18 strains of bacteria selected randomly. Type one which dominated 61% of the total bacteria was highly similar withPseudomonas. The maps of PCR-DGGE showed that the bacteria reduced gradually before spoilaged,and there was only one single band of bacteria at last. Sequencing analysis results of DGGE bands showed that there were three types of bacteriaPseudomonassp.,AeromonasandAcinetobacterin the Tilapia Wastes enzymatic hydrolysates,Pseudomonasfluorescenswas the predominant bacteria when spoilaged,this conclusion was consistent with RFLP.

Tilapia wastes;enzymatic hydrolysates;specific spoilage organism;restriction fragment length polymorphism(RFLP);PCR-DGGE

2015-11-09

沈志華(1982-),男,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:shenzhihua123@126.com。

崔春(1978-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:cuichun@scut.edu.cn。

國家863項(xiàng)目(2014AA093602)。

TS264.9

A

1002-0306(2016)10-0199-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.032