不同酶水解對雞蛋清蛋白降解和潛在致敏性的影響

王　艷,龍彩云,夏佳恒,楊安樹,*,陳紅兵

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

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不同酶水解對雞蛋清蛋白降解和潛在致敏性的影響

王艷1,2,龍彩云1,2,夏佳恒1,2,楊安樹1,2,*,陳紅兵1,2

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

酶水解是降低食物過敏原致敏性的一種常用手段,本文分別利用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解雞蛋清蛋白,通過三羥甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE),并結合水解度(鄰苯二甲醛法)分析監(jiān)測蛋清蛋白的酶解過程,進一步利用制備的兔抗蛋清蛋白多克隆抗體血清和雞蛋過敏患者血清池評估酶解產(chǎn)物的抗原性和致敏性。結果表明:木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶能夠有效的水解蛋清蛋白,并且所得酶解產(chǎn)物的抗原性和致敏性較低,其中,木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白后產(chǎn)物的抗原性降低了59.23%,致敏性降低了4.91%;堿性蛋白酶水解蛋清蛋白后產(chǎn)物的抗原性降低了57.61%,致敏性降低了4.55%。因此,木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對雞蛋清蛋白降解及致敏性降低方面均有顯著影響。

蛋清蛋白,酶水解,雞蛋過敏,降解,潛在致敏性

我國的雞蛋產(chǎn)量位居世界第一,雞蛋營養(yǎng)價值高,蛋白含量豐富,其蛋清蛋白約占蛋清質量的10%～12%,含有人體所必需的多種氨基酸,是一種理想的蛋白質資源[1]。但是,雞蛋也是一種常見的過敏食物,位居食物過敏排行榜的第二位[2-5]。據(jù)流行病學調查表明,雞蛋過敏占嬰幼兒和兒童食物過敏的35%[6],占成年人食物過敏的12%[7]。目前公認的雞蛋主要過敏原有6種,分別是溶菌酶(Lys,Gal d4)、卵類黏蛋白(OVM,Gal d1)、卵轉鐵蛋白(OVT,Gal d3)、卵白蛋白(OVA,Gal d2)、α-卵黃蛋白(α-livetin,Gal d5)和卵黃糖蛋白(YGP42,Gal d6)[8-10],其中卵類粘蛋白(Gal d1)、卵白蛋白(Gal d2)、卵轉鐵蛋白(Gal d3)和溶菌酶(Gal d4)存在于蛋清中[11-13]。迄今為止,雞蛋過敏尚無特效療法,嚴格避免食用含雞蛋的食物是過敏患者的最佳選擇。但完全避免食用雞蛋很困難;而且容易造成雞蛋過敏患者營養(yǎng)不良和膳食結構紊亂。目前,主要通過熱處理、酶解法、糖基化反應及發(fā)酵等加工方法降低雞蛋致敏性,在這些加工方法中,酶解被認為是降低食物致敏性最有效的方法之一[14]。

蛋白質酶解是利用蛋白水解酶在一定條件下對蛋白質分子進行催化水解,使大分子蛋白降解成不同鏈長的小分子,引起蛋白質結構變化。研究發(fā)現(xiàn)酶解不僅可以降低雞蛋蛋清蛋白致敏性,而且酶解生成的寡肽更易于被人體消化吸收,大大提高了雞蛋蛋清蛋白在食品工業(yè)中的應用范圍[15-16],與原蛋白相比,水解產(chǎn)物的溶解性、起泡性及黏度等功能特性得到了改善,且具有降血脂、降血壓和抗氧化等生理活性[17-20]。當前,關于雞蛋清蛋白酶解產(chǎn)物的功能性和生理活性研究較多,而針對其酶解產(chǎn)物的抗原性和致敏性研究還相當缺乏。

因此本文利用不同蛋白酶水解蛋清蛋白,通過鄰苯二甲醛法和Tricine-SDS-PAGE電泳檢測酶解產(chǎn)物的水解度和分子量分布;同時,以蛋清蛋白為抗原,通過皮下多點注射免疫日本大耳兔,制備出特異性較高的抗蛋清蛋白多克隆抗體血清;進一步利用制備的多抗血清和過敏患者血清池評估水解產(chǎn)物的抗原性和致敏性,篩選出降低血清蛋白致敏性效果較佳的蛋白酶。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅殼雞蛋江西省南昌市青山湖區(qū)天虹商場;日本大耳兔飼養(yǎng)于江西省實驗動物質量監(jiān)測站,飼養(yǎng)過程中確保食物中不含有任何雞蛋成分,飼養(yǎng)一周無異常后,準備免疫,免疫之前采集陰性血清;雞蛋過敏患者血清廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院;牛血清白蛋白(BSA)標準品、40%凝膠貯液、小分子蛋白Marker、二硫蘇糖醇(DTT)上海生工;弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG二抗、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鄰苯二甲醛(OPA)、生物素標記羊抗人IgE二抗Sigma公司;中性蛋白酶、堿性蛋白酶諾維信公司;HRP-鏈霉親和素欣博盛公司;蛋清蛋白的CAP、校正用CAP瑞典法瑪雅公司;其它常規(guī)試劑均為分析純。

Mode 680型酶聯(lián)免疫檢測儀、蛋白電泳儀美國BIO-RAD公司;HJ-A6型恒溫磁力攪拌水浴鍋常州邁科諾儀器有限公司;ImmunoCAP儀器瑞典法瑪雅公司;TU-1901型紫外分光光度計日本日立公司。

1.2實驗方法

1.2.1蛋清蛋白分離方法參考佟平[21]并稍作改進。取紅殼雞蛋,用分蛋器分離蛋清與蛋黃,玻璃棒輕攪至蛋清中無膠狀物質后,加入等體積的蒸餾水稀釋,用1 mol/L HCl調pH至6.0,除去蛋清中的卵黏蛋白。4 ℃下連續(xù)攪拌3 h,2500×g下離心30 min,取上清,同時利用考馬斯亮藍法測其蛋白濃度,于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抗蛋清蛋白多克隆抗體的制備方法參考楊苗等[22]并稍作改進。選取2只8周齡大的雄性日本大耳兔,質量約為25 kg,分別標記為1#和2#,首次免疫將弗氏完全佐劑(CFA)與等體積蛋清蛋白乳化后于背部皮下多點注射免疫兔子,免疫劑量為200 μg/只,之后每隔兩周以弗氏不完全佐劑與等體積蛋清蛋白乳化后免疫兔子,劑量為200 μg/只,共免疫6次。前期采用耳緣靜脈取血,在第12周對2只兔子進行股動脈采血,每次取血后分離血清,利用間接ELISA方法和考馬斯亮藍法分別測定大耳兔血清抗體效價和濃度。效價指的是抗原抗體反應時,出現(xiàn)明顯反應終點的抗血清或抗原制劑的最高稀釋度。

1.2.3蛋清蛋白的酶解方法參考金曉君[23]并稍作改進。將蛋清用0.02 mol/L pH為7.2磷酸鹽緩沖液稀釋至一定濃度后,用2 mol/L NaOH調pH至10.0,轉入沸水浴中使其迅速升溫至85 ℃,并水浴保溫30 min,取出,冷卻至室溫。選用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶為水解酶,以5000 U/g的比例加入蛋白水解酶,分別在酶各自最適溫度及最適pH下(見表1)進行水解,一定時間后取出樣品,并高溫鈍化酶以終止水解反應。1個酶活力單位指在測定條件下,每分鐘水解酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物在275 nm波長的吸光度與1 μg酪氨酸的吸光度相當時所需的酶量,以(U/g或U/mL)表示。

表1　蛋白酶活性、最適溫度及pH

1.2.4酶解蛋清蛋白水解度和分子量的測定

1.2.4.1酶解蛋清蛋白水解度的測定酶解過程中水解度的測定采用Church[24]的鄰苯二甲醛(OPA)法并加以改進。具體方法為:以精氨酸作為標準品,繪制標準曲線。取400 μL樣品溶液加入到盛有3 mL OPA的離心管中,混勻5 s,避光反應2 min,同時做空白對照實驗,未水解樣代替,340 nm下測定吸光值,按標準曲線計算水解度如下:

h=(ht-hc)×DFDH(%)=h/htot×100

式中,ht-樣品的吸光度從標曲上查得的濃度;hc-對照品(未水解樣品)的吸光度從標曲上查得的濃度;htot-全部酶解液的吸光度從標準曲線上查得的濃度;DH-樣品的水解度;DF-樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.4.2酶解蛋清蛋白分子量的測定方法參考Kasera R[25]和Sch?gger H[26]并稍作改進。酶解產(chǎn)物分子量通過Tricine-SDS-PAGE電泳檢測,具體步驟如下:分別取10 μL不同時間點收集的水解物與等體積的上樣緩沖液混勻,于恒溫孵育器中100 ℃孵育5 min,取出離心,上樣15 μL進行Tricine-SDS-PAGE電泳。濃縮膠的電泳條件為30 V、1 h,分離膠(夾層膠和致密膠)的電泳條件為100 V、2 h。

1.2.5蛋清蛋白過敏患者血清池的構建方法參考Johansson S G O[27]。從收集的食物過敏患者血清中挑選出14個疑似雞蛋過敏患者血清,采用ImmunoCAP儀器分別測定這些血清對蛋清蛋白的特異性IgE值。將呈輕度過敏以上的血清按等體積混合,得到蛋清蛋白過敏患者血清池。另外,陰性對照的血清取自對雞蛋不過敏的正常健康者。

1.2.6抗原性與致敏性的評估采用競爭抑制 ELISA 檢測不同的蛋清蛋白酶解產(chǎn)物與兔多克隆抗體 IgG和過敏患者血清IgE的結合能力。抗原性IgG的檢測方法參考Tong[28],致敏性IgE檢測方法參考Ma[29]。

IgG(或IgE)抑制率(%)=(1-B/B0)×100

B:有競爭蛋白對應的OD值;B0:無競爭蛋白時的OD值。

抑制率越高時,表明該競爭蛋白殘余的IgG/IgE反應性越強,即抗原性/致敏性越強。

1.2.7數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析所有實驗至少重復三次,數(shù)據(jù)分析采用SPSS統(tǒng)計分析軟件,如不特別說明,結果用平均值±標準偏差表示。統(tǒng)計顯著性分析用單因素方差分析,以p≤0.05表明具有顯著性。不同的小寫字母(柱狀圖上方)表示顯著性差異。

2　結果與討論

2.1抗蛋清蛋白兔多克隆抗體的制備

免疫過程中抗血清效價的變化見圖1。從圖1中可知,隨著免疫次數(shù)的增加,抗血清效價也隨之上升,到第十周時(p≤0.05),抗血清效價將不再上升,因此,在第12周對2只兔子進行股動脈采血,分離血清,最終得到血清抗體的效價為50000。

圖1　免疫過程中抗體效價變化Fig.1　Change of the antibody titer during immunization

抗原的純度越高,一般制備的多克隆抗體的效價越高[21]。本研究中,由于蛋清蛋白不是單一蛋白,而是多種蛋白的混合物[12]。因此所制得的多克隆抗體效價達50000。同時,抗原的免疫劑量也能影響免疫抗體的產(chǎn)生,劑量過低,不能引起足夠強的免疫刺激;若免疫劑量過多,有可能引起免疫耐受,或者導致動物的死亡。在0～8周時,抗體的效價隨著免疫劑量的增加而增高。免疫劑量與免疫周期也有關,兩次注射的間隔時間若太短,則起不到再次免疫的效果,太長則又失去了前一次激發(fā)的敏感作用。在本實驗中采取隔兩周對家兔進行一次免疫。

2.2Tricine-SDS-PAGE電泳分析結果

蛋清蛋白經(jīng)4種蛋白酶水解不同時間后,利用Tricine-SDS-PAGE電泳檢測酶解產(chǎn)物分子量分布,結果如圖2所示。

圖2顯示,加入蛋白酶酶解后,泳道2中的高聚物被迅速酶解,木瓜蛋白酶水解時,蛋清蛋白在10 min內(nèi)被迅速水解成分子量小于25 ku的片段,隨著酶解的進行,在25 ku附近出現(xiàn)一條新的條帶,并逐漸清晰,該片段可能是由于酶解形成的小片段通過疏水相互作用聚集形成。同樣,堿性蛋白酶水解時,蛋清蛋白也被迅速降解、形成大量分子量介于3.5～30 ku的小分子肽段。中性蛋白酶水解時,酶解產(chǎn)物電泳圖顯示,從濃縮膠與分離膠界面到5 ku范圍內(nèi),夾層膠與濃縮膠之間仍然有少量的聚集物,不同酶解時間所得產(chǎn)物均呈現(xiàn)出模糊條帶,這表明水解形成了一系列分子量介于5～30 ku的多肽。在胃蛋白酶的酶解產(chǎn)物電泳圖中,蛋清蛋白主要被酶解成一系列低于45 ku的片段,但仍有一個分子量約40 ku的多肽片段經(jīng)過180 min的酶解,仍然抗胃蛋白酶水解,這與Thomas[30]、Dearman[31]、Takagi[32]、Martos[33]等的研究結果一致,表明卵白蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后,會產(chǎn)生40 ku的抗酶解片段。由Tricine-SDS-PAGE電泳圖的直觀反映,木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對蛋清蛋白的酶解效果最好。然而電泳只能從一個側面反映過敏蛋白分子的降解效果,不能反映決定致敏性的過敏原表位的變化。

圖2　不同酶水解蛋清蛋白所得產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE電泳圖Fig.2　Tricine-SDS-PAGE analysis of hydrolysates of egg white注:A:木瓜蛋白酶;B:堿性蛋白酶;C:中性蛋白酶;D:胃蛋白酶;泳道1:小分子Marker;泳道2～9:酶解時間分別為0、10、30、60、90、120、150、180 min的產(chǎn)物。

2.3蛋清蛋白酶解產(chǎn)物水解度的變化

蛋清蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解后的水解度變化如圖3所示,不同蛋白酶在其適宜條件下對蛋清蛋白的水解程度不同,隨著酶解反應的進行,水解產(chǎn)物濃度增加,底物濃度減少,酶活性降低,水解度達到整個反應進程的90%以上時,水解度就不再有大的變化。由圖3可知,木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度最高,為27.6%,其次是堿性蛋白酶,為24.77%,中性蛋白酶與胃蛋白酶水解產(chǎn)物相當,分別為12.37%和11.66%。此水解度結果與小分子電泳圖結果相符合。

圖3　四種蛋白酶酶解蛋清蛋白水解度的變化Fig.3　Hydrolysis degree of hydrolysates of egg white

2.4酶解產(chǎn)物與IgG的結合能力

采用競爭抑制ELISA法評估加熱處理和酶水解對蛋清蛋白IgG結合能力的影響,結果見圖4所示。

圖4　熱處理(A)和蛋白酶水解(B)對蛋清蛋白IgG結合能力的影響Fig.4.　Effect of heat-treatment(A) and enzymatic hydrolysis(B)on IgG binding of egg white

圖4(A)顯示,蛋清蛋白在85 ℃下熱處理30 min,蛋白濃度在1 mg/mL時的抑制率小于40%,表明蛋清蛋白經(jīng)熱處理后,其抗原性顯著降低,再經(jīng)酶水解后,抗原性進一步降低,則酶解產(chǎn)物無法與天然蛋清蛋白競爭反應,因此,本研究利用熱處理的蛋清蛋白包被酶標板,與酶解產(chǎn)物做競爭反應,計算其抑制率(圖4B)。由圖4(B)可知,木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶對蛋清蛋白的抑制率顯著(p≤0.05)低于其他兩種蛋白酶水解產(chǎn)物,抑制率越低,說明木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶水解對蛋清蛋白抗原性影響較大,抗原性降低程度較大。木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白后產(chǎn)物抗原性降低了59.23%,堿性蛋白酶水解蛋清蛋白后產(chǎn)物抗原性降低了57.61%,中性蛋白酶和胃蛋白酶水解蛋清蛋白后產(chǎn)物抗原性分別降低了9.17%和32.75%。

2.5酶解產(chǎn)物與IgE的結合能力

用競爭抑制ELISA檢測各種蛋清蛋白酶解產(chǎn)物與雞蛋過敏患者血清的IgE結合能力,結果如圖5所示。從圖5中可以得出,利用木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶水解蛋清蛋白,其水解產(chǎn)物的致敏性低于中性蛋白酶與胃蛋白酶水解蛋清蛋白產(chǎn)物的致敏性。其中木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白后產(chǎn)物致敏性降低了4.91%,堿性蛋白酶水解蛋清蛋白后產(chǎn)物致敏性降低了4.55%。

競爭抑制ELISA結果與Tricine-SDS-PAGE電泳圖和水解度呈現(xiàn)較為一致的檢測結果,利用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解蛋清蛋白,能有效降低酶解產(chǎn)物的抗原性和致敏性。雖然木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶顯示了較其他蛋白酶好的降低致敏性的效果,但蛋清蛋白的致敏性依然存在,因此后續(xù)研究可以采用多酶水解或與其他方法配合使用,以達到蛋清蛋白的完全脫敏。

圖5　不同蛋白酶酶解對蛋清蛋白IgE結合能力的影響Fig.5　Effect of enzymatic hydrolysis on IgE binding of egg white

3　結論

探討了蛋清蛋白水解過程中不同蛋白酶對其降解和潛在致敏性的影響。蛋清蛋白經(jīng)加熱前處理后,再利用蛋白酶水解,隨著酶解時間的延長,蛋清蛋白的水解度逐漸增加,對四種蛋白酶而言,蛋清蛋白的降解程度以木瓜蛋白酶最高,其次是堿性蛋白酶,中性蛋白酶與胃蛋白酶相當。不同蛋白酶水解后,蛋清蛋白的抗原性和致敏性均降低,其中木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白后產(chǎn)物抗原性降低了59.23%,致敏性降低了4.91%,堿性蛋白酶水解蛋清蛋白后產(chǎn)物抗原性降低了57.61%,致敏性降低了4.55%。

[1]張鐵華,殷涌光,劉靜波. 高壓脈沖電場(PEF)對蛋清蛋白功能特性的影響[J]. 食品科學,2007,28(9):98-102.

[2]佟平,高金燕,陳紅兵. 一步層析法分離高純度蛋清過敏原卵轉鐵蛋白[J]. 食品工業(yè)科技,2010(6):100-102.

[3]Eggesb? M,Botten G,Halvorsen R,et al. The prevalence of allergy to egg:A population-based study in young children[J]. Allergy,2001,56(5):403-411.

[4]Sampson H A. Update on food allergy[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology,2004,113(5):805-819.

[5]Heine R G,Laske N,Hill D J. The diagnosis and management of egg allergy[J]. Current allergy and asthma reports,2006,6(2):145-152.

[6]Dd. M. Food allergens[J]. Clinical Reviews in Allergy and Immunology,1985(3):331-349.

[7]Mine Y,Rupa P. Immunological and biochemical properties of egg allergens[J]. World’s Poultry Science Journal,2004,60(3):321-330.

[8]Mine Y,Yang M. Recent advances in the understanding of egg allergens:basic,industrial,and clinical perspectives[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(13):4874-4900.

[9]Jacobsen B,Hoffmann-Sommergruber K,Have T T,et al. The panel of egg allergens,Gal d 1-Gal d 5:Their improved purification and characterization[J]. Molecular nutrition & food research,2008,52(S2):S176-S185.

[10]Amo A,Rodriguez-Perez R,Blanco J,et al. Gal d 6 is the second allergen characterized from egg yolk[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(12):7453-7457.

[11]楊萬根,王璋,許時嬰. 蛋清酶解前的變性條件研究[J]. 食品工業(yè)科技,2007,28(2):123-125.

[12]聶君,楊哪,金征宇,等. 不同加工處理方式對蛋清致敏的影響[J]. 食品與生物技術學報,2011,30(4):1673-1689.

[13]Thomas K,Aalbers M,Bannon G,et al. A multi-laboratory evaluation of a commoninvitropepsin digestion assay protocol used in assessing the safety of novel proteins[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology,2004,39(2):87-98.

[14]龍彩云,熊江花,簡姍,等. 酶解法在雞蛋脫敏中的應用研究進展[J]. 食品科學,2013,34(1):340-344.

[15]Rao Q,Rocca-Smith J R,Labuza T P. Storage stability of hen egg white powders in three protein/water dough model systems[J]. Food chemistry,2013,138(2):1087-1094.

[16]楊瑾,唐傳核. 雞蛋清蛋白水解物的抗氧化性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2011,27(12):1446-1450.

[17]Chen C,Chi Y J,Xu W. Comparisons on the functional properties and antioxidant activity of spray-dried and freeze-dried egg white protein hydrolysate[J]. Food and Bioprocess Technology,2012,5(6):2342-2352.

[18]周利亙,王君虹,張治國,等. 中性蛋白酶水解蛋清蛋白的工藝[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學,2011,1(2):335-337.

[19]CHEN Chen,CHI Yujie,XU Wei. Comparisons on the functional properties and antioxidant activity of spray-dried and freeze-dried egg white protein hydrolysate[J]. Food and Bioprocess Technology,2012,5(6):2342-2352.

[20]MINE Y. Egg proteins and peptides in human health-chemistry,bioactivity and production[J]. Current Pharmaceutical Design,2007,13(9):875-884.

[21]佟平. 雞蛋卵轉鐵蛋白線性表位定位及熱加工對其結構與過敏原性的影響[D]. 南昌:南昌大學,2011.

[22]楊苗,侯先志,楊銀芬,等. 牛β-酪蛋白多克隆抗體的制備及鑒定[J]. 中國獸醫(yī)科學,2010,40(11):1180-1183.

[23]金曉君. 雞蛋清酶解工藝優(yōu)化及酶解產(chǎn)物對小鼠肝臟抗氧化指標影響[D]. 揚州:揚州大學,2011.

[24]Church F C,Swaisgood H E,Porter D H,et al. Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins[J].Journal of Dairy Science,1983,66(6):1219-1227.

[25]Kasera R,Singh A B,Lavasa S,et al. Enzymatic hydrolysis:A method in alleviating legume allergenicity[J]. Food and Chemical Toxicology,2015,76:54-60.

[26]Sch?gger H. Tricine-SDS-PAGE[J]. Nature Protocols,2006,1:16-22.

[27]Johansson S G O. ImmunoCAP? Specific IgE test:an objective tool for research and routine allergy diagnosis[J]. Expert Review of Molecular Diagnostics,2004,4(3):273-279.

[28]Tong P,Gao J,Chen H,et al. Effect of heat treatment on the potential allergenicity and conformational structure of egg allergen ovotransferrin[J]. Food Chemistry,2012,131(2):603-610.

[29]Ma X,Lozano-Ojalvo D,Chen H,et al. Effect of high pressure-assisted crosslinking of ovalbumin and egg white by transglutaminase on their potential allergenicity[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2015,29:143-150.

[30]Thomas K,Aalbers M,Bannon G,et al. A multi-laboratory evaluation of a commoninvitropepsin digestion assay protocol used in assessing the safety of novel proteins[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology,2004,39(2):87-98.

[31]Dearman R,Caddick H,Stone S,et al. Immunogenic properties of rapidly digested food proteins following gavage exposure of mice:a comparison of ovalbumin with a potato acid phosphatase preparation[J]. Food and Chemical Toxicology,2002,40(5):625-633.

[32]Takagi K,Teshima R,Okunuki H,et al. Comparative study ofinvitrodigestibility of food proteins and effect of preheating on the digestion[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin,2003,26(7):969-973.

[33]Martos G,Contreras P,Molina E,et al. Egg white ovalbumin digestion mimicking physiological conditions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(9):5640-5648.

Effects of enzymatic hydrolysis by different enzyme on the degradation and potential allergenicity of egg white protein

WANG Yan1,2,LONG Cai-yun1,2,XIA Jia-heng1,2,YANG An-shu1,2,*,CHEN Hong-bing1,2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China; 2.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Enzymatic hydrolysis is considered as one of the common ways to reduce the allergenicity of food allergens. In this study,the egg white proteins were hydrolyzed with pepsin,papain,neutrase and alcalase. Enzymatic hydrolysis process of egg white protein was sequentially monitored by Tricine-sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis(Tricine-SDS-PAGE)and the degree of hydrolysis(o-phthaldialdehyde). Immunoglobulin G(IgG)and immunoglobulin E(IgE)binding of the hydrolysates were evaluated by rabbit anti-egg white protein sera and egg allergy patients’ serum pool. The results showed that the papain and alcalase could effectively hydrolyze egg white protein,and the hydrolysates also showed the low antigenicity and allergenicity. The antigenicity and allergenicity of the hydrolysates with papain were reduced by 59.23% and 4.91%,respectively,and the antigenicity and allergenicity of the hydrolysates with alcalase protease were reduced by 57.61% and 4.55%,respectively. In conclusion,papain and alcalase protease have a significant impact on degrading egg white proteins and reducing the potential allergenicity.

egg white proteins;enzymatic hydrolysis;egg allergy;degradation;potential allergenicity

2015-10-08

王艷(1991-),女,碩士研究生,研究方向:食品加工與安全,E-mail:wangyanwhf@aliyun.com。

楊安樹(1972-),男,博士,教授,研究方向:食品科學,E-mail:yanganshu@ncu.edu.cn。

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)資助(2013AA102205);國家自然科學基金項目(31460439);江西省青年科學家培養(yǎng)對象計劃(20122BCB23006);江西省科技廳對外科技合作計劃項目(20142BDH80002);江西省科技廳知識產(chǎn)權局項目(20143BBM26107)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)10-0194-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.031