生物絮凝劑產(chǎn)生菌的人工選育及污水處理試驗

田連生，陳秀清

（揚州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇省環(huán)境生物工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇揚州225127）

生物絮凝劑產(chǎn)生菌的人工選育及污水處理試驗

田連生，陳秀清

（揚州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇省環(huán)境生物工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇揚州225127）

為提高絮凝劑產(chǎn)生菌MS-2的絮凝效果，采用紫外線誘變和化學(xué)誘變相結(jié)合的方法對該出發(fā)菌株進行人工選育，獲得性能優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定的變異菌株HZU-1，其絮凝率達到97.6%，比原菌株提高了43.1%。還研究了pH、投加量對其絮凝活性的影響，并進行了生物絮凝劑與聚合氯化鋁處理城市生活污水的對比試驗。

生物絮凝劑；紫外誘變；化學(xué)誘變；污水處理

微生物絮凝劑主要成分為多糖、蛋白質(zhì)等生物聚合物，因此，較化學(xué)類絮凝劑具有高效、無毒、易于生物降解、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點，在工業(yè)污水處理、飲用水凈化等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者對微生物絮凝劑的研究正逐步深入〔1-6〕，特別是美國、日本等國家在20世紀70年代后，對微生物絮凝劑在污水處理方面進行了深入研究，也取得了較多成果〔7-8〕。而我國對微生物絮凝劑研究起步較晚，大多還處于實驗室研究階段，還沒有工業(yè)化產(chǎn)品應(yīng)用。近年來很多學(xué)者就提高絮凝效果、降低產(chǎn)品成本及發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面做了大量基礎(chǔ)研究工作〔9-11〕。但在生物絮凝劑產(chǎn)生菌采用誘變育種方面的研究報道較少。采用物理誘變、化學(xué)誘變對野生菌株進行人工選育，不僅可改善菌種特性、提高絮凝活性，還可開發(fā)新品種。

本實驗室從污水處理廠的活性污泥中經(jīng)分離、純化后，篩選出1株絮凝劑產(chǎn)生菌株MS-2。為了提高該菌株的絮凝活性、減少投加量、降低使用成本以提高處理效果，筆者采用紫外線誘變和化學(xué)誘變相結(jié)合的方法，對其進行人工選育，獲得遺傳穩(wěn)定性良好的變異菌株HZU-1，HZU-1絮凝率達到97.6%，比原菌株提高了43.1%。并研究了該菌株pH、投加量對其絮凝效果的影響，同時進行了該生物絮凝劑與聚合氯化鋁處理城市生活污水的對比試驗。

1　材料與方法

1.1試驗菌株

絮凝劑產(chǎn)生菌MS-2，由本實驗室從活性污泥中分離篩選出的菌株。

1.2培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8～10g，K2HPO41～3g，KH2PO41～2 g，NaCl 0.1～0.3 g，尿素0.4～0.6 g，酵母膏0.5～0.7 g，蒸餾水1 000mL，pH 7.0～7.2。

篩選培養(yǎng)基：葡萄糖6～8 g，鄰苯二甲酸二異辛酯8～11 g，K2HPO41～2 g，KH2PO40.5～1 g，NaCl0.1～0.3 g，尿素0.5 g，酵母膏0.6～0.8 g，瓊脂18～20 g，硫酸錳0.001～0.003g，蒸餾水980～1 000mL，pH 7.0～7.5。

1.3種子培養(yǎng)

從冷藏保存的種子斜面上，取一環(huán)絮凝劑產(chǎn)生菌MS-2，接入裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃、120 r/min下震蕩培養(yǎng)30 h，離心分離菌體，用生理鹽水制成106mL-1數(shù)量級的細胞懸浮液備用。

1.4紫外線誘變

取上述備用的細胞懸浮液0.1mL，在無菌條件下，均勻涂布于裝有篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表面，將培養(yǎng)皿置于20W紫外燈下30 cm處分別避光照射50、80、110 s，培養(yǎng)皿用黑紙包好，于30℃恒溫、避光培養(yǎng)，每次處理作3個平行試驗。3 d后挑取生長狀態(tài)好的單菌落，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中作為選育菌種，于30℃、120 r/min震蕩培養(yǎng)30 h，分別取樣測這些菌種發(fā)酵液對高嶺土懸濁液的絮凝率。并以未經(jīng)照射的MS-2接種的發(fā)酵培養(yǎng)液作比對。

1.5化學(xué)誘變

取優(yōu)選的紫外誘變菌株一環(huán)，接種于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃、120 r/min下震蕩培養(yǎng)30 h，離心收集細胞，用無菌生理鹽水和0.1mol/L磷酸鉀緩沖溶液（pH=7.0）各洗滌1～2次后，將洗好的細胞懸浮于含有8 g/L的5-溴尿嘧啶（BU）的磷酸鉀緩沖溶液（pH=7.0）中，30℃、120 r/min震蕩培養(yǎng)40min；取10mL處理后的懸液用0.16mol/L硫代硫酸鈉溶液100mL稀釋，離心收集細胞，用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖溶液和無菌水各洗滌1次后，取0.1～0.2mL勻涂在篩選培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)，從平板上挑取較大單菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中作為選育菌種，于30℃、120 r/min震蕩培養(yǎng)30 h，取樣測這些菌種發(fā)酵液對高嶺土懸濁液的絮凝率，并以MS-2發(fā)酵液作比對。

1.6絮凝率測定方法

在150mL量筒中加入100mL高嶺土（4 g/L）懸濁液，加1%的CaCl2溶液4mL和3mL待測菌液，200 r/min快速攪拌2min，100 r/min攪拌5min，靜置15min后，取上清液測定550 nm處吸光度。同時以未接菌種的液體培養(yǎng)作對照，根據(jù)吸光度的變化計算絮凝率。

1.7pH對絮凝效果的影響

取100mL高嶺土（4g/L）懸濁液，加1%的CaCl2溶液4mL，調(diào)節(jié)pH分別為4、5、6、7、8、9、10，加入3mL的HZU-1發(fā)酵液，分別測不同pH條件下的絮凝率。

1.8投入量對絮凝率的影響

取100mL高嶺土（4 g/L）懸濁液，加1%的CaCl2溶液4mL，調(diào)節(jié)pH=7，分別按1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL投入MS-2或HZU-1的發(fā)酵液，考察發(fā)酵液投加量對絮凝率的影響。

1.9城市生活污水處理試驗

從污水處理廠取城市生活污水2 000mL，維持溫度25℃左右，調(diào)節(jié)pH=7，按30mL/L的比例投入生物絮凝劑HZU-1的發(fā)酵液，在200 r/min轉(zhuǎn)速下快速攪拌5min，然后調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為80 r/min，慢速攪拌10min，停止攪拌。把處理液投入沉降池中，靜置沉降40min，取澄清液分別測定COD、BOD、SS、色度、pH等指標(biāo)。放出澄清液，把沉降池底部排出的沉淀物經(jīng)離心分離后，測定沉淀物質(zhì)量（濕重）。每次處理重復(fù)3次，取平均值。依照上述方法，按30mL/L投入聚合氯化鋁（質(zhì)量分數(shù)30%）溶液，并測定處理污水后的各項指標(biāo)，作為比對。

各檢測指標(biāo)的分析方法：COD，重鉻酸鹽法；BOD，稀釋與接種法；SS，用WZS-185高濁度儀測定；色度，稀釋倍數(shù)法；pH，玻璃電極法。

2　結(jié)果與分析

2.1紫外線誘導(dǎo)

經(jīng)紫外線誘變處理，產(chǎn)生4株變異菌株，經(jīng)過純化培養(yǎng)，分別標(biāo)記為ZU-1～ZU-4。照射時間為50 s時，誘導(dǎo)產(chǎn)生2株突變菌株，照射時間為80 s時，誘導(dǎo)產(chǎn)生2株突變菌株。照射時間為110 s時，已無突變菌株產(chǎn)生。ZU-1、ZU-2、ZU-3、ZU-4、MS-2各菌株發(fā)酵液對高嶺土懸濁液的絮凝率分別為：73.0%、90.9%、89.8%、86.6%、68.2%。

可以看出，誘變選育的4株變異菌株絮凝率均比原菌株MS-2有所提高，其中ZU-2和ZU-3絮凝效果最好，絮凝率分別達到90.9%和89.8%，比原菌株MS-2 68.2%的絮凝率提高了33.3%、31.7%?？梢娮贤饩€誘變效果顯著，并把ZU-2作為化學(xué)誘變的出發(fā)菌株。

2.2化學(xué)誘變

利用5-溴尿嘧啶（BU）對ZU-2菌株進行化學(xué)誘變。經(jīng)過初篩和復(fù)篩，篩選出5株變異菌株，分別標(biāo)記為HZU-1～HZU-5。經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，測定HZU-1、HZU-2、HZU-3、HZU-4、HZU-5、MS-2對高嶺土懸濁液的絮凝率分別為：97.6%、92.7%、90.8%、95.7%、93.5%、68.2%。

可以看出，經(jīng)過化學(xué)誘變后，各變異菌株的絮凝率均有不同程度的提高，尤其是HZU-1，其絮凝率達到97.6%，比原出發(fā)菌株MS-2提高了43.1%，且遺傳穩(wěn)定性良好。雖然HZU-4的絮凝率也較高，但遺傳穩(wěn)定性較差。最后筆者選擇HZU-1作為生物絮凝劑選育菌株，并進行后續(xù)實驗。

2.3pH對絮凝效果的影響

HZU-1發(fā)酵液的初始pH對絮凝率的影響見圖1。

圖1　初始pH對絮凝率的影響

由圖1可以看出，隨著pH升高，HZU-1的絮凝率迅速增加，在pH=7時達到最大值；之后隨著pH升高絮凝率反而快速下降。這可能是因為處理液的H+和OH-能改變微生物絮凝劑產(chǎn)生的生物聚合體的帶電狀態(tài)和絮凝物質(zhì)顆粒表面性質(zhì)〔12〕，從而影響絮凝效果。

2.4投加量對絮凝效果影響

HZU-1發(fā)酵液投加量對絮凝效果影響見圖2。

圖2　投加量對絮凝率的影響

由圖2可見，隨著投加量的增加，MS-2和HZU-1絮凝率均迅速增加，在投加量為3mL時，MS-2和HZU-1同時出現(xiàn)最大值，然后隨著投加量的增加，絮凝率均出現(xiàn)下降現(xiàn)象。這可能是因為過多投入發(fā)酵液，系統(tǒng)黏度增大，反而降低絮凝活性。另外，在相同投加量下，HZU-1絮凝率均高于菌株MS-2?？梢娫谶_到相同絮凝率下，投加HZU-1可大幅降低絮凝劑投加量，從而降低使用成本。

2.5生活污水處理結(jié)果

分別用生物絮凝劑HZU-1、聚合氯化鋁處理生活污水，結(jié)果見表1。

表1　生活污水處理效果

由表1可以看出，生物絮凝劑HZU-1處理的城市生活污水，水樣各項指標(biāo)均優(yōu)于聚合氯化鋁處理。另外，HZU-1處理污水后，沉淀物顆粒較大，易于過濾脫水，可縮短沉降處理時間，且具有較好的脫色效果，能提高污水處理效率和處理后的水質(zhì)。

3　結(jié)論

（1）采用紫外線誘變和化學(xué)誘變相結(jié)合的方法，選育出突變菌株HZU-1，其對高嶺土懸濁液的絮凝率達到97.6%且遺傳穩(wěn)定性良好。

（2）HZU-1發(fā)酵液的初始pH對微生物絮凝劑絮凝率的影響很大，在pH=7時絮凝率達到最大值。

（3）HZU-1菌株絮凝活性優(yōu)良，處理污水時投加量少，排出沉淀物較聚合氯化鋁少，且可生物降解，可避免對環(huán)境造成二次污染。同時，處理水樣的各項指標(biāo)均優(yōu)于目前廣泛應(yīng)用的聚合氯化鋁。

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Tests on the artificialbreeding ofbioflocculant-producing strain and sewage treatment

Tian Liansheng，Chen Xiuqing
（Yangzhou Polytechnic Institute，Jiangsu Province Research&DevelopmentCenterof Environmental&Biological Engineering，Yangzhou 225127，China）

To improve the flocculation effect of flocculant-producing strain MS-2，themethod of combining UV inducedmutation with chemicalmutation isused for the artificialbreeding ofstrains，and，asa result，a kind ofmutant strain，HZU-1 with excellent performances and stable heredity，has been obtained.Its flocculating rate reaches 97.6%，which is43.1%higher than thatof theoriginalstrain.The influencesofpH and dosageon its flocculatingactivity are studied，and contrastexperimentson using biological flocculating agentand polyaluminium chloride for the treatmentofurban domestic sewageare accomplished.

bioflocculant；UVmutagenesis；chemicalmutagenesis；sewage treatment ?

TQ085+.413

A

1005-829X（2016）03-0047-04

江蘇省省科技攻關(guān)項目（06169186D）

田連生（1962—），教授。E-mail：lianshengt@163.com。

2016-01-16（修改稿）