基底前腦巢蛋白陽性膽堿能神經(jīng)元抗損傷作用

王緩緩，朱建華

（大理大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，云南大理　671000）

基底前腦巢蛋白陽性膽堿能神經(jīng)元抗損傷作用

王緩緩，朱建華*

（大理大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，云南大理671000）

目的：探索基底前腦巢蛋白陽性和陰性膽堿能神經(jīng)元對神經(jīng)毒性損傷的不同反應(yīng)。方法：30只SD大鼠隨機分成5個組，即對照組和秋水仙堿Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組（10、20、50、100 μg）。分別經(jīng)側(cè)腦室注射10 μL生理鹽水或不同劑量的秋水仙堿，24 h 后4%多聚甲醛灌注取腦，冰凍切片，行膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和巢蛋白免疫組化。計數(shù)和分析基底前腦不同區(qū)域巢蛋白陽性和陰性膽堿能神經(jīng)元的數(shù)目。結(jié)果：側(cè)腦室秋水仙堿注射后，大鼠基底前腦不同區(qū)域巢蛋白陽性和陰性膽堿能神經(jīng)元數(shù)目都下降。注射劑量越大，神經(jīng)元數(shù)目下降越明顯。與巢蛋白陽性神經(jīng)元相比，巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元下降出現(xiàn)更早，下降更明顯。結(jié)論：巢蛋白表達可增強基底前腦膽堿能神經(jīng)元的抗損傷作用。

基底前腦；巢蛋白；膽堿能神經(jīng)元；神經(jīng)可塑性

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.08.009

基底前腦主要含有膽堿能神經(jīng)元、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元。這些神經(jīng)元發(fā)出纖維投射到海馬和大腦皮質(zhì)，與學習記憶密切相關(guān)。近年發(fā)現(xiàn)成年大鼠和成人的基底前腦都有一個連續(xù)的巢蛋白免疫反應(yīng)陽性（nestin-immunoreactive，nestin-ir）的細胞帶〔1-2〕。Nestin-ir細胞特異性地分布于基底前腦，能表達神經(jīng)元特異性稀醇化酶（neuro-specific enolase，NSE）和神經(jīng)元特異性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN），但不表達膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），而且其形態(tài)及大小均與成熟的神經(jīng)元相似〔2〕。用膜片鉗技術(shù)與單細胞RT-PCR技術(shù)，免疫熒光三標與激光共聚焦掃描術(shù)證實基底前腦的巢蛋白陽性神經(jīng)元是一類成熟的神經(jīng)元，屬于膽堿能神經(jīng)元的一種亞型〔3-4〕。與巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元相比，巢蛋白陽性的膽堿能神經(jīng)元具有較大的超極化激活的內(nèi)向電流（Ih）和較大的興奮性突觸后電流〔3〕。因此，巢蛋白陽性和巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元在學習記憶及其他生理活動中可能具有功能差異性。本研究通過不同劑量的秋水仙堿側(cè)腦室注射，觀察秋水仙堿對巢蛋白陽性和巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元的數(shù)目影響，以探索兩種神經(jīng)元的神經(jīng)可塑性差異。

1　材料和方法

1.1實驗動物SD大鼠30只，體重（250±20）g，由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證編號：SYXK（滇）2005-0004。實驗過程中所有動物均飼養(yǎng)于相同環(huán)境，自然明暗周期，自由進食進水，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。采用隨機數(shù)字表法將動物分為5個組，即：正常對照組、秋水仙堿Ⅰ組（10 μg）、秋水仙堿Ⅱ組（20 μg）、秋水仙堿Ⅲ組（50 μg）、秋水仙堿Ⅳ組（100 μg），每組大鼠6只。

1.2實驗試劑秋水仙堿（華美生物公司，sigma），用滅菌生理鹽水配制成1%的濃度；兔抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（anti-choline acetyltransferase，ChAT）多克隆抗體，工作濃度：1：1 000；小鼠抗巢蛋白（anti-nestin）單克隆抗體，工作濃度：1：2 000。兩種抗體均購于Merck Millipore公司。常規(guī)免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3側(cè)腦室注射各組大鼠均使用1%戊巴比妥鈉腹膜腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上，按PAXINOS和WATSON〔5〕編著的大鼠腦立體定位圖譜，以前囟點為參照，在前囟后0.4 mm、左側(cè)1.5 mm 和4.6 mm深度用微量進樣器向左側(cè)側(cè)腦室分別注入10 μL滅菌生理鹽水，或10、20、50、100 μg的秋水仙堿。

1.4取腦與切片各組大鼠在側(cè)腦室注射術(shù)后24 h經(jīng)心臟進行4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取腦，腦組織用4%多聚甲醛后固定4 h，然后依次置于15%及30%蔗糖磷酸緩沖液中4℃保存脫水，直至沉底。冰凍切片，片厚30 μm，每隔5張切片取一片。

1.5免疫組化使用免疫組化ABC法進行ChAT及巢蛋白測定。切片先入0.3%H2O2，室溫30 min；1% BSA（含0.3%Triton X-100）37℃30 min；一抗37℃孵育2 h后置4℃冰箱過夜；二抗、三抗分別在37℃溫箱孵育2 h；0.05%DAB（含0.01%H2O2）室溫顯色時間3 min。以上除1%BSA封閉后直接入一抗外，其余各步驟之間均用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）漂洗5 min，3次。貼片后晾干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.6細胞計數(shù)及統(tǒng)計分析按照文獻方法，計數(shù)注射側(cè)基底前腦內(nèi)側(cè)隔核（medial septum，MS）、斜角帶核水平垂直支（vertical diagonal band，vDB）和水平支（horizontal diagonal band，hDB）的ChAT及巢蛋白陽性神經(jīng)元。因為以往的研究已證實巢蛋白陽性神經(jīng)元是膽堿能神經(jīng)元的一個亞群，而免疫組化雙標染色影響因素較多，故本實驗以相鄰腦片分別進行ChAT和巢蛋白免疫組化測定，以ChAT陽性神經(jīng)元的數(shù)目減去巢蛋白陽性神經(jīng)元的數(shù)目作為巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元數(shù)目。用SPSS13.2專業(yè)統(tǒng)計軟件，單因素方差分析（ANOVA）分析各組大鼠MS、vDB和hDB兩種神經(jīng)元的數(shù)目總體差異，使用LSD檢驗進行各均數(shù)間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

基底前腦ChAT及巢蛋白陽性神經(jīng)元分布區(qū)域一致，分布于MS、vDB及hDB，形成一個從MS到 vDB的倒“V”字形的條帶。在MS處的巢蛋白陽性神經(jīng)元較小，常呈梭形，垂直排列；在vDB及hDB處的巢蛋白陽性神經(jīng)元較大，常為多角形。

對照組大鼠基底前腦巢蛋白陽性和巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元數(shù)目之間差異無統(tǒng)計學意義。側(cè)腦室秋水仙堿注射后，大鼠基底前腦MS、vDB及hDB 3個區(qū)域巢蛋白陽性和巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元的數(shù)目都發(fā)生下降。隨著秋水仙堿注射劑量增大，兩種神經(jīng)元的數(shù)目下降更加明顯，當秋水仙堿側(cè)腦室注射量達到20 μg時hDB的巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元與巢蛋白陽性膽堿能神經(jīng)元之間開始出現(xiàn)顯著性差異；當注射量達到100 μg時，MS、vDB和hDB的巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元與巢蛋白陽性膽堿能神經(jīng)元之間差異均有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1　不同劑量的秋水仙堿注射后巢蛋白陽性和巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元的數(shù)目

秋水仙堿的注射量為10 μg時，基底前腦MS和vDB的巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元數(shù)目與對照組之間差異具有統(tǒng)計學意義。見圖1。但側(cè)腦室注射秋水仙堿的量達到20 μg以后，基底前腦hDB、MS和vDB的巢蛋白陽性膽堿能神經(jīng)元的數(shù)目與對照組之間才依次出現(xiàn)統(tǒng)計學差異。見圖2。

圖1　秋水側(cè)堿側(cè)腦室注射后基底前腦巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元數(shù)目的變化

圖2　秋水側(cè)堿側(cè)腦室注射后基底前腦巢蛋白陽性膽堿能神經(jīng)元的變化

3　討論

巢蛋白是一種Ⅵ型中間絲蛋白，主要在神經(jīng)前體細胞一過性表達，當神經(jīng)前體細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元之后由其他的中間絲蛋白取代，因此，巢蛋白常作為特異性的標記物，廣泛用于活體和體外培養(yǎng)的神經(jīng)前體細胞鑒定〔7-8〕。在正常成年腦組織中，巢蛋白主要在具有神經(jīng)發(fā)生功能的部位（如室管膜下區(qū)和海馬齒狀回），血管內(nèi)皮細胞〔9-11〕以及激活的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達〔12〕。然而，最近發(fā)現(xiàn)成年大鼠基底前腦和成人的基底前腦都有一個連續(xù)的nestin-ir神經(jīng)元構(gòu)成的細胞帶〔1-2〕。研究表明，受試大鼠基底前腦的nestin-ir神經(jīng)元數(shù)量與大鼠的平均逃避潛伏期呈顯著的負相關(guān)關(guān)系〔13〕。以上結(jié)果提示老年性記憶減退的神經(jīng)機制與基底前腦的nestin-ir神經(jīng)元退變關(guān)系密切。通過免疫熒光三標與激光共聚焦掃描術(shù)、單細胞RT-PCR及電生理的研究表明基底前腦的巢蛋白陽性神經(jīng)元是一類成熟的神經(jīng)元，屬于膽堿能神經(jīng)元，數(shù)目約占膽堿能神經(jīng)元的50%〔3〕。因此，基底前腦膽堿能神經(jīng)元可根據(jù)是否表達巢蛋白分為兩個亞群，即巢蛋白陽性的膽堿能神經(jīng)元與巢蛋白陰性的膽堿能神經(jīng)元〔3-4〕。

秋水仙堿是一種有絲分裂毒素，以往研究表明側(cè)腦室注射秋水仙堿能導(dǎo)致基底前腦的膽堿能神經(jīng)元不可逆性減少〔14〕。早期的研究表明大鼠側(cè)腦室注射秋水仙堿后，巢蛋白陽性神經(jīng)元一過性降低后可以恢復(fù)，提示表達巢蛋白的神經(jīng)元有較好的可塑性〔15〕。切斷嗅神經(jīng)后，經(jīng)基底前腦巢蛋白陽性和陰性的膽堿能神經(jīng)元數(shù)都會減少，但巢蛋白陽性神經(jīng)元數(shù)目減少遲于巢蛋白陰性的膽堿能神經(jīng)元，提示巢蛋白陽性神經(jīng)元對機械損傷有更強的耐受性〔16〕。

最初發(fā)現(xiàn)基底前腦的巢蛋白陽性神經(jīng)元時，巢蛋白陽性神經(jīng)元被認為是基底前腦膽堿能神經(jīng)元和γ-氨基丁酸能神經(jīng)元之外的一類獨立的神經(jīng)元。周立兵等曾進行過秋水仙堿毀損巢蛋白陽性神經(jīng)元的試驗，側(cè)腦室秋水仙堿注射后24 h基底前腦巢蛋白陽性神經(jīng)元數(shù)目降到最低〔15〕。但后來的研究進一步揭示巢蛋白陽性神經(jīng)元是膽堿能神經(jīng)元的一個亞群，膽堿能神經(jīng)元可分為巢蛋白陽性和巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元。因此，與以往的實驗不同，本實驗主要是比較巢蛋白陽性和巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元對不同劑量的秋水仙堿毒性損傷反應(yīng)的差異。

本實驗在側(cè)腦室內(nèi)注射不同劑量的秋水仙堿，發(fā)現(xiàn)隨著注射劑量的增加，基底前腦巢蛋白陽性和巢蛋白陰性膽堿能神經(jīng)元的數(shù)目都減少。其中巢蛋白陰性的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目減少出現(xiàn)得更早，減少得更明顯。提示巢蛋白陽性的膽堿能神經(jīng)元對秋水仙堿引起的神經(jīng)元損傷有更強的耐受性。另外，側(cè)腦室秋水仙堿注射導(dǎo)致的基底前腦神經(jīng)元減少是有區(qū)域差異性的，MS和vDB的神經(jīng)元較早受到影響，而hDB神經(jīng)最后才出現(xiàn)損害。這可能跟基底前腦不同區(qū)域與側(cè)腦室的距離不同有關(guān)。

結(jié)合前期研究的發(fā)現(xiàn)巢蛋白陽性的膽堿能神經(jīng)元并不是新生的神經(jīng)元〔17〕，可以認為巢蛋白表達使膽堿能神經(jīng)元維持一種特殊的功能狀態(tài)。這種狀態(tài)賦予神經(jīng)元特定的功能（如較大的興奮性）和較大的生存能力，因此，當受到有害因子的刺激時不容易出現(xiàn)損傷和死亡。巢蛋白對神經(jīng)元功能的影響及其意義仍需進一步研究。

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〔Abstract〕Objective:To explore the different responses of basal forebrain nestin positive and negative cholinergic neurons to the neurotoxicity.Methods:30 SD rats were randomly divided into 5 groups，which are control group and colchicineⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳgroups （10，20，50，100 μg）.10 microliters of normal saline or different doses of colchicine were injectedintracerebroventricularly.24 hours after injection，4%paraformaldehyde intracardiac perfusion，brain removal，frozen section，choline acetyltransferase and nestin immunohistochemistry were carried out.Then，the nestin positive and negative cholinergic neurons of different basal forebrain regions were counted and analyzed.Results:After intracerebroventricular injection of colchicine，the nestin positive and negative cholinergic neurons in different regions of rats'basal forebrain decreased.The greater the colchicine injection dose is，the more obvious the decrease of the neurons.Compared with nestin positive neurons，the nestin negative cholinergic neurons decreased earlier and more significantly.Conclusion:the nestin expression can enhance the damage resistant ability of basal forebrain cholinergic neurons.

〔Key words〕basal forebrain；nestin；cholinergic neurons；neural plasticity

（責任編輯李楊）

Damage Resistance of Basal Forebrain Nestin-positive Cholinergic Neurons

Wang Huanhuan，Zhu Jianhua*
（Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

R322.81

A

2096-2266（2016）08-0035-04

國家自然科學基金資助項目（31160221）

2016-02-26

王緩緩，碩士研究生，主要從事神經(jīng)生物學研究.

朱建華，教授，博士.