戶太八號(hào)葡萄酒優(yōu)勢(shì)釀酒酵母的選育研究

葛含靜，楊苗苗（陜西學(xué)前師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，陜西西安710100）

戶太八號(hào)葡萄酒優(yōu)勢(shì)釀酒酵母的選育研究

葛含靜，楊苗苗
（陜西學(xué)前師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，陜西西安710100）

為得到西安地區(qū)特有葡萄品種——戶太八號(hào)自然發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)釀酒酵母菌株，首先利用YEPD培養(yǎng)基從其自然發(fā)酵各時(shí)期的醪液中篩選得到155株酵母菌，再利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行表型鑒定，得到102株釀酒酵母。再經(jīng)發(fā)酵性能和耐受力（酒精度、糖濃度、酸濃度、SO2濃度）的測(cè)定，菌株NJ7的發(fā)酵指標(biāo)最好，以其小試發(fā)酵戶太八號(hào)桃紅葡萄酒，酒液理化指標(biāo)與感官評(píng)價(jià)都優(yōu)于商品化釀酒酵母D254，具備工業(yè)化發(fā)酵應(yīng)用潛力。

釀酒酵母；發(fā)酵性能；耐受力

葡萄酒香氣成分多達(dá)上千種，其中400多種是由酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生［1］。不同的酵母菌作用各不相同，使葡萄酒具有不同的風(fēng)味特征，賦予葡萄酒不同的品質(zhì)及風(fēng)味，它們是決定葡萄酒質(zhì)量的重要因素之一［2-3］。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是葡萄酒釀造過(guò)程中的主要微生物，可修正酒精發(fā)酵過(guò)程中的香氣成分，還可產(chǎn)生特殊的發(fā)酵香氣［4］。各種葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中接種的釀酒酵母不同，因而代謝途徑有所差異，發(fā)酵香氣也不同，具有獨(dú)特的游離香氣，使葡萄酒具有各自獨(dú)特的香氣特征［5-7］。然而目前，許多葡萄酒企業(yè)大量使用進(jìn)口活性釀酒酵母，如此一來(lái)，雖然葡萄酒的發(fā)酵速率和產(chǎn)品質(zhì)量得以穩(wěn)定，卻導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)同質(zhì)化嚴(yán)重，大大降低了本土釀酒酵母對(duì)葡萄酒香氣成分的貢獻(xiàn)［8-9］。

西安地區(qū)具有規(guī)?；钠咸逊N植基地，蘊(yùn)藏著豐富的本土酵母資源。戶太八號(hào)是西安地區(qū)特有的葡萄品種。通過(guò)對(duì)其自然發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母特性的研究，選育出優(yōu)勢(shì)釀酒酵母菌種，從而為生產(chǎn)地域特色的葡萄酒提供良好的菌種保證。

1　材料

1.1材料

2013年9月中旬從西安市白鹿原葡萄產(chǎn)區(qū)采集成熟的戶太八號(hào)葡萄果實(shí)，自然釀造制酒；商品釀酒酵母D254。

1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基［10］：葡萄糖5%，（NH4）2SO40.2%，KH2PO40.25%，MgSO4·7H2O 0.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，酵母膏0.05%，滅菌后加Na2SO330 mg/L。如制固體培養(yǎng)基，加瓊脂2%。

分離培養(yǎng)基（YEPD培養(yǎng)基）：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。如制固體培養(yǎng)基，加瓊脂2%。保藏培養(yǎng)基與活化培養(yǎng)基同分離培養(yǎng)基。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基［11］：酵母浸粉0.4%，蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%。無(wú)機(jī)鹽類：KH2PO40.055%，KCl 0.042 5%，CaCl20.0125%，MgSO40.0125%，F(xiàn)eCl30.002 5%，MnSO40.000 25%，溴酚綠22 mg/L，pH5.5。

所有培養(yǎng)基均在121℃高壓滅菌15 min后備用。

2　方法

2.1釀酒酵母的篩選

將成熟度良好的戶太八號(hào)葡萄破碎，裝入2個(gè)2 L滅菌的發(fā)酵瓶中，每瓶裝1 200 mL，25℃自然發(fā)酵，其中一瓶加入40mg/L SO2作對(duì)照，做2組平行試驗(yàn)。在發(fā)酵的前、中、后期分別量取酒樣10mL，加入到100mL液體富集培養(yǎng)基中，25℃、170 r/min培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水按不同濃度梯度稀釋，吸取0.2 mL，均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板，25℃培養(yǎng)72 h，選擇菌落生長(zhǎng)良好且密度適宜的平板，隨機(jī)挑取10個(gè)～20個(gè)單菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接，并多次劃線培養(yǎng)以獲得純酵母菌株，保藏于試管斜面，4℃冰箱保存。

將保藏的酵母菌種接種于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基，25℃、170 r/min活化24 h，劃線接種于WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)72 h，觀察并記錄單菌落特征。根據(jù)釀酒酵母在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的特殊的菌落特征，篩選出釀酒酵母。

2.2優(yōu)勢(shì)釀酒酵母的篩選

初篩：向大試管中加入杜氏發(fā)酵管，再加入25 mL新鮮戶太八號(hào)葡萄汁，滅菌后接入活化的釀酒酵母，并加入40 mg/L SO2，25℃培養(yǎng)。以杜氏管法測(cè)定發(fā)酵菌株的起酵時(shí)間、氣味、發(fā)酵力以及凝聚性，作為發(fā)酵性能的指標(biāo)。以空白作對(duì)照。

復(fù)篩：向1 L新鮮戶太八號(hào)葡萄汁接入3%初篩菌株種子液，并加入40 mg/L SO2，定時(shí)搖瓶，25℃恒溫培養(yǎng)。以12 h為時(shí)間間隔進(jìn)行稱重，直到恒重（失重小于0.2 g/d）即停止發(fā)酵。以酒香、酒精度、總酸、凝聚性、總糖以及發(fā)酵力作為復(fù)篩指標(biāo)。以空白作對(duì)照。

2.3釀酒酵母的耐受力測(cè)定

按3%接種量分別向不同無(wú)水乙醇濃度（6%、9%、 12%、15%、18%，體積分?jǐn)?shù)）、SO2濃度（50、100、150、200、250 mg/L）、酒石酸濃度（8%、10%、12%、15%、20%）和葡萄糖濃度（100、200、300、400、500 g/L）的10 mL戶太八號(hào)葡萄汁中接入活化的釀酒酵母菌液，25℃培養(yǎng)48 h，以杜氏管法測(cè)定酵母的耐受力。按3%接種量接入復(fù)選的酵母菌液，分別于10、15、20、25、30、35℃做發(fā)酵試驗(yàn)，全程定時(shí)測(cè)定發(fā)酵速率。以商品化酵母D254為對(duì)照。

2.4小試發(fā)酵生產(chǎn)戶太八號(hào)桃紅葡萄酒

在裝有10 L新鮮戶太八號(hào)葡萄漿果的發(fā)酵罐中按1.0%接種量接種釀酒酵母，篩選出優(yōu)勢(shì)菌株，并加入40 mg/L的SO2，25℃溫度條件下發(fā)酵5 d后進(jìn)入終止期，酒樣經(jīng)5 000 r/min離心后，測(cè)定酒精度、總酸、總糖、單寧、色度、花色苷和總酚的含量；以葡萄酒的滋味、澄清度、酒體香氣和酒體的色澤作為葡萄酒的感官指標(biāo)。以D254作對(duì)照。

3　結(jié)果與討論

3.1釀酒酵母的篩選與鑒定

將從戶太八號(hào)葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中篩選的155株酵母菌接種于WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后，篩選出102株在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上呈奶油色，略帶淡綠，球形突起，表面光滑，不透明的菌株，具有典型釀酒酵母的形態(tài)特征。

大量文獻(xiàn)表明，WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中的絕大多數(shù)酵母菌具有很好的鑒別力［12-15］。更有文獻(xiàn)表明，WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)釀酒酵母的鑒別準(zhǔn)確度可達(dá)100%［16-18］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定的準(zhǔn)確性，從102株上述菌株中隨機(jī)挑選3株進(jìn)行5.8S ITS序列鑒定，確定為釀酒酵母。綜上，可以確定，通過(guò)WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基篩選出的102株酵母菌為釀酒酵母。3.2優(yōu)勢(shì)釀酒酵母的篩選

對(duì)102株釀酒酵母進(jìn)行初篩，選出起酵快、繁殖力強(qiáng)、發(fā)酵性能良好的釀酒酵母菌株NJ1、NJ3、NJ7、NJ12、NJ24共5株，結(jié)果見(jiàn)表1（略去棄用的150株酵母菌初篩指標(biāo)）。

表1　優(yōu)勢(shì)釀酒酵母初篩結(jié)果Table 1　The results of primarily screening for good Saccharomyces cerevisiae

將這5株酵母進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見(jiàn)表2。

可以看出：SO2對(duì)NJ1和NJ24有明顯的抑制作用，且它們產(chǎn)酒香氣一般，殘?zhí)橇看?，故棄用；NJ12殘?zhí)橇枯^大，可能是生長(zhǎng)代謝過(guò)程中受到了SO2和酒精的抑制，亦棄用；選擇殘?zhí)橇康?、酒精度高、發(fā)酵力強(qiáng)和產(chǎn)酒香氣良好的NJ3和NJ7為最終復(fù)篩菌株。

表2　 優(yōu)勢(shì)釀酒酵母復(fù)篩結(jié)果Table 2　The results of re-screening for good Saccharomyces cerevisiae

3.3復(fù)篩釀酒酵母的耐受性能比較

3.3.1酒精耐受試驗(yàn)

接種16 h后，酒精度對(duì)菌株NJ7與D254發(fā)酵延遲時(shí)間影響不大，但菌株NJ3酒精耐受性能較差，見(jiàn)圖1。

圖1　復(fù)篩釀酒酵母酒精濃度耐受試驗(yàn)Fig.1　Alcohol tolerance tests for re-screening strains and contrast strain D254

由圖1可知，酒精度為18%時(shí)，發(fā)酵完全被抑制；酒精度為15%時(shí)，NJ7與D254有極為緩慢的發(fā)酵；酒精度在9%～12%時(shí)，發(fā)酵速率急劇下降；酒精度在6%～9%時(shí)，對(duì)發(fā)酵速率影響不大。工業(yè)化葡萄酒釀造過(guò)程中酒精度一般為10%～13%，3株菌在此酒精度時(shí)均能夠持續(xù)發(fā)酵［19］。

3.3.2糖濃度耐受試驗(yàn)

3株釀酒酵母均有較廣的糖濃度耐受范圍，見(jiàn)圖2。

圖2　復(fù)篩釀酒酵母糖濃度耐受試驗(yàn)Fig.2　Sugar tolerance tests for re-screening strains and contrast strain D254

由圖2可知，糖濃度在100 g/L～300 g/L區(qū)間，發(fā)酵速率均顯著降低；當(dāng)含糖量增加到400 g/L時(shí)，發(fā)酵延遲，發(fā)酵速率減緩，發(fā)酵時(shí)間增加，發(fā)酵受到了明顯的抑制；糖濃度為500 g/L時(shí)，發(fā)酵現(xiàn)象均不明顯，發(fā)酵受到進(jìn)一步抑制。因此，3株菌糖耐受性都良好。

3.3.3酒石酸耐受試驗(yàn)

3株釀酒酵母均有較強(qiáng)的酸耐受性能，見(jiàn)圖3。

圖3　復(fù)篩釀酒酵母酒石酸濃度耐受試驗(yàn)Fig.3　Tartaric acid tolerance tests for re-screening strains and contrast strain D254

由圖3可知，3株菌起酵時(shí)間基本一致；隨著酒石酸濃度逐漸增加，3株菌發(fā)酵速率均呈逐漸降低趨勢(shì)；當(dāng)酒石酸含量在10 g/L～12 g/L時(shí)，發(fā)酵速率降幅最大。因此，3株酵母的酸耐受性能都較強(qiáng)。

3.3.4SO2耐受試驗(yàn)

3株釀酒酵母對(duì)SO2均有較好的耐受性，見(jiàn)圖4。

圖4　復(fù)篩釀酒酵母SO2濃度耐受試驗(yàn)Fig.4　SO2tolerance tests for re-screening strains and contrast strain D254

由圖4可知，SO2濃度在50 mg/L～150 mg/L時(shí)，起酵時(shí)間均隨SO2濃度升高而增長(zhǎng)，但發(fā)酵速率均呈降低趨勢(shì)；SO2濃度在100 mg/L～150mg/L時(shí)，發(fā)酵速率急劇降低；SO2濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，發(fā)酵受到明顯抑制，發(fā)酵速率進(jìn)一步降低，NJ3發(fā)酵速率降幅更快；當(dāng)SO2濃度為250 mg/L時(shí)，發(fā)酵幾乎完全被抑制；NJ3耐SO2性能較差，其發(fā)酵受SO2濃度影響比較明顯。然而，SO2在葡萄汁中添加量一般為60 mg/L，3株菌在此SO2濃度下均可持續(xù)發(fā)酵［20］。

3.3.5溫度對(duì)發(fā)酵速率的影響

3株釀酒酵母的發(fā)酵溫度范圍均較寬，見(jiàn)圖5。

圖5　復(fù)篩釀酒酵母發(fā)酵溫度試驗(yàn)Fig.5　Fermentation temperature tests for re-creening strains and contrast strain D254

由圖5可知，在10℃～35℃溫度區(qū)間，3株菌均能發(fā)酵；10℃時(shí)發(fā)酵較慢，隨著溫度逐漸上升，發(fā)酵速率均呈上升趨勢(shì)，在25℃時(shí)達(dá)到最高，之后陡然下降；在25℃～30℃時(shí)，發(fā)酵周期相對(duì)較短。故，3株菌均有較寬的發(fā)酵溫度范圍，可耐受較高溫度。

綜合4個(gè)耐受性試驗(yàn)和不同溫度下發(fā)酵性能試驗(yàn)的結(jié)果可知：酵母菌種NJ7在酒精耐受試驗(yàn)、耐糖試驗(yàn)、耐酸試驗(yàn)及SO2耐受試驗(yàn)中，綜合耐受性能接近D254；釀酒酵母NJ3在耐糖及耐酸方面與NJ7和D254不相上下，但在耐酒精和耐SO2方面明顯低于NJ7和D254，故棄用NJ3。最終確定NJ7為優(yōu)勢(shì)戶太八號(hào)葡萄酒釀酒酵母。

3.4小試發(fā)酵生產(chǎn)戶太八號(hào)桃紅葡萄酒

釀酒酵母NJ7和D254所釀葡萄酒的理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，感官評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表3　葡萄酒理化指標(biāo)Table 3　Properties of wine

表4　葡萄酒感官評(píng)定Table 4　Sensory evaluations of wine

由表3和表4可知：釀酒酵母NJ7與D254發(fā)酵所得葡萄酒各項(xiàng)理化指標(biāo)差異不太顯著，除菌株NJ7發(fā)酵后酒樣的色度和花色苷含量略低于商品酵母D254發(fā)酵的酒樣，其余理化指標(biāo)均高于D254發(fā)酵的酒樣；兩者感官評(píng)定基本一致。綜合分析各指標(biāo)結(jié)果，菌株NJ7的發(fā)酵葡萄酒參數(shù)高于商品化酵母D254，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

4　結(jié)論

從西安產(chǎn)區(qū)戶太八號(hào)葡萄自然發(fā)酵醪液中優(yōu)選出了釀酒酵母NJ7，用于戶太八號(hào)桃紅葡萄酒釀造試驗(yàn)，結(jié)果顯示釀酒酵母菌株NJ7發(fā)酵酒樣參數(shù)較好，香氣濃郁，各項(xiàng)指標(biāo)接近商品化釀酒酵母，具備工業(yè)化葡萄酒釀造應(yīng)用潛力。

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Screening of Good Saccharomyce scerevisiae from Wine Fermented with No.8 Hutai Grapes

GE Han-jing，YANG Miao-miao （Department of Biology Science and Technology，Shaanxi Xueqian Normal University，Xi'an 710100，Shaanxi，China）

In order to screen good Saccharomyce scerevisiae strain from spontaneous fermentation with No.8 Hutai Grape，which was the unique species in Xi'an.Firstly，155 yeasts strains were isolated with Yeast Extract Peptone Dextrose medium（YEPD medium）during spontaneous fermentation.And then，102 Saccharomyce scerevisiae strains were screened on Wallerstein Laboratory Nutrient Agar（WL agar）by phenotypic identification.Finally，strain NJ7 was screened as good Saccharomyce scerevisiae by tests of fermentation characteristics and tolerance to alcohol，sugar，acid and SO2.Additionally，small-scale volume production of No.8 Hutai wine with strain NJ7 was carried out.The results showed that the wine sample made by strain NJ7 had even better properties and sensory evaluations than the commercial yeast D254，so has potential applications in wine brewing industry.

Saccharomycescerevisiae；fermentationcharacteristics；tolerance

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.045

陜西學(xué)前師范學(xué)院博士研究生科研專項(xiàng)項(xiàng)目（2014DS001）；陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2016JQ3036）；陜西省科技廳農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目（2016NY-204）

葛含靜（1981—），女（漢），講師，博士，研究方向：糧食工程與發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新。

2015-04-09