花臉香蘑菌絲體液體發(fā)酵研究

胡先運(yùn)，江家志（黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州都勻558000）

花臉香蘑菌絲體液體發(fā)酵研究

胡先運(yùn)，江家志
（黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州都勻558000）

對(duì)花臉香蘑液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以菌絲體生物量為指標(biāo)，采用單因素分析，優(yōu)化培養(yǎng)基中碳源、氮源、pH值、無(wú)機(jī)鹽以及菌齡。結(jié)果表明，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，最佳碳源為土豆粉；最佳氮源為NH4Cl；最佳pH值為7；無(wú)機(jī)鹽為CuSO4和FeSO4；菌齡對(duì)菌絲體生物量沒(méi)有影響。采用正交試驗(yàn)的方法，篩選出適合于花臉香蘑深層發(fā)酵培養(yǎng)配方為：碳源為土豆粉；氮源為NH4Cl；pH值為7；無(wú)機(jī)鹽為FeSO4；菌齡12d。

花臉香蘑；菌絲體；發(fā)酵

花臉香蘑［Lepista sordida（Fr）Sing］，又名紫晶口蘑、丁香蘑、花臉蘑等。其子實(shí)體細(xì)、柔軟、脆嫩、清香適口、味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，是一種具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的菌［1］。德國(guó)學(xué)者Xenia Mazur［2］等用Lepista.sordida菌株發(fā)酵分離出具有抗癌、抗菌的二萜骨架化合物；肖玉珍等［3］，羅心毅等［4-5］，申慧彥等［6］先后對(duì)菌種人工馴化，子實(shí)體礦質(zhì)元素，氨基酸，菌絲營(yíng)養(yǎng)特性進(jìn)行了研究。目前，液體發(fā)酵能夠快速獲得發(fā)酵產(chǎn)物，為獲得次生代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。然而，花臉香蘑液體培養(yǎng)條件探索處于探索階段，主要是對(duì)碳源和氮源展開探索［7-9］，本文采用液體培養(yǎng)菌絲體的生物量為指標(biāo)，篩選了適宜于花臉香蘑的液體培養(yǎng)基，為液體菌種大規(guī)模生產(chǎn)和代謝產(chǎn)物研究提供參考。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

花臉香蘑［Lepista sordida（Fr）Sing］：2004年12月貴州省生物研究所菌種室饋贈(zèng)子實(shí)體，菌種分離，純化，編號(hào)為L(zhǎng)ps-93001，并保存于貴州省生物研究所菌種室。

1.1.2培養(yǎng)基

1）菌種分離純化固體培養(yǎng)基（CPDA培養(yǎng)基）：土豆200g、MgSO41.5g、KH2PO43g、酵母膏4g、瓊脂15g、pH=6.0，配制1000mL；培養(yǎng)溫度：24℃。

2）液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：土豆200g、MgSO41.5g、KH2PO43g，配制1000 mL。

1.2方法

1.2.1菌種的分離及生長(zhǎng)

采菇形好，生長(zhǎng)強(qiáng)壯，無(wú)污染的子實(shí)體，在CPDA培養(yǎng)基中，進(jìn)行分離，純化，24℃，恒溫培養(yǎng)并記錄菌絲生長(zhǎng)情況。

1.2.2菌絲體生物量測(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)3 000 r/min離心10 min，菌絲體60℃恒溫真空干燥至恒重，即為菌絲體干重作為生物量。

1.2.3單因子試驗(yàn)

用500 mL三角瓶，裝入選擇性培養(yǎng)基200 mL，接種塊大小約1.0 cm2，培養(yǎng)溫度27℃，振蕩器轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)10 d，測(cè)量菌絲干重。

1.2.4碳源對(duì)生物量的影響

以不同碳源，如：土豆粉、葡萄糖、乳糖和蔗糖各4 g，分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每組重復(fù)5次，培養(yǎng)，干燥稱重，得到不同碳源條件下的菌絲體干重。

1.2.5氮源對(duì)生物量的影響

以不同氮源，如：酵母膏、KNO3、NH4NO3、NH4Cl各0.8 g，分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每組重復(fù)5次，培養(yǎng)，干燥稱重，得到不同氮源條件下的菌絲體干重。

1.2.6不同pH值對(duì)生物量的影響

用濃度0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH值分別調(diào)至5、6、7、8，每組重復(fù)5次，培養(yǎng)，干燥稱重，得到不同pH值條件下的菌絲體干重。

1.2.7不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)生物量的影響

將不同無(wú)機(jī)鹽，如：NiSO4、CuSO4、FeSO4各3×10-4g，分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每組重復(fù)5次，培養(yǎng)，干燥稱重，得到不同無(wú)機(jī)鹽條件下的菌絲體干重。

1.2.8不同菌齡對(duì)生物量的影響

將菌齡分別為4、8、12、16 d，分別接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每組重復(fù)5次，培養(yǎng)，干燥稱重，得到不同菌齡條件下的菌絲體干重。

1.2.9正交試驗(yàn)優(yōu)化菌絲體液體深層發(fā)酵培養(yǎng)條件

500 mL三角瓶裝量為200 mL培養(yǎng)基，接不同時(shí)期Lps-93001菌種，接種塊大小約1.0 cm2，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl調(diào)pH值。以碳源2 g/100 mL，氮源0.4 g/100 mL，無(wú)機(jī)鹽1.5×10-4g/100 mL，pH值及菌齡為因素，每個(gè)因素4個(gè)水平，使用L16（45）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。共有16個(gè)組合，每個(gè)組合設(shè)5個(gè)重復(fù)。正交試驗(yàn)L16（45）因素水平見(jiàn)表1，振蕩器轉(zhuǎn)速120 r/min，27℃培養(yǎng)14 d。

2　結(jié)果與討論

2.1菌種的分離及生長(zhǎng)

花臉香蘑菌絲在CPDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率見(jiàn)圖1。

圖1　 花臉香蘑菌絲在CPDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率Fig.1　Mycelia growth rate of Lepista sordida in CDPA medium

由圖1可知，花臉香蘑菌絲在CPDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，粗壯，在培養(yǎng)過(guò)程中，菌絲初期為灰白色絨毛狀，后為淡紫色、紫色。7天后開始著淡紫色于培養(yǎng)基上，菌絲在前3天生長(zhǎng)較慢，后逐漸加快，在11 d到13d時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率達(dá)到最大為0.56cm/d。此后菌絲生長(zhǎng)較慢，平均生長(zhǎng)速度0.28 cm/d，長(zhǎng)滿試管約17 d。

表1　正交試驗(yàn)L16（45）因素水平表Table 1　The design of factors and levels on orthogonal experiment

2.2碳源對(duì)菌絲體液體發(fā)酵的影響

不同碳源對(duì)花臉香蘑液體發(fā)酵的影響見(jiàn)圖2。

如圖2所示，土豆粉對(duì)菌絲體發(fā)酵的生物量影響最大，達(dá)到1.402 g/200 mL，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中土豆粉是最容易吸收的供試碳源，且與葡萄糖、乳糖、蔗糖為供試碳源相比，達(dá)到0.1水平上的顯著差異；葡萄糖和蔗糖作為供試碳源，兩者沒(méi)有顯著差異；菌絲體發(fā)酵對(duì)乳糖的利用最差。分析結(jié)果表明，花臉香蘑菌絲體液體發(fā)酵最佳碳源為土豆粉；其次為葡萄糖和蔗糖，最差為乳糖。

2.3氮源對(duì)菌絲體液體發(fā)酵的影響

不同氮源對(duì)花臉香蘑液體發(fā)酵的影響見(jiàn)圖3。

如圖3所示，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，供試氮源為NH4Cl

圖2　不同碳源對(duì)花臉香蘑液體發(fā)酵中生物量的影響Fig.2　The effect of carbon sources on the biomass of mycelia in liquid fermentation

圖3　不同氮源對(duì)花臉香蘑液體發(fā)酵中生物量的影響Fig.3　The effect of nitrogen sources on the biomass of mycelia in liquid fermentation

時(shí)，能使花臉香蘑液體發(fā)酵的生物量達(dá)到最大，達(dá)到1.181 g/200 mL，且與其他3種供試氮源酵母膏、KNO3、NH4NO3相比，達(dá)到顯著性差異，說(shuō)明在花臉香蘑液體發(fā)酵中，最佳供試氮源為NH4Cl；其次為KNO3為1.012 g/200 mL，利用率最差為酵母膏和NH4NO3。

2.4pH值對(duì)菌絲體液體發(fā)酵的影響

pH值對(duì)菌絲體液體發(fā)酵的影響見(jiàn)圖4。

圖4　pH對(duì)花臉香蘑液體發(fā)酵中生物量的影響Fig.4　The effect of pH on the biomass of mycelia in liquid fermentation

由圖4可知，花臉香蘑菌絲體發(fā)酵對(duì)pH值適應(yīng)范圍較廣，在pH值范圍為5～8時(shí)都能生長(zhǎng)。在酸性條件下，隨著pH值升高，花臉香蘑液體發(fā)酵生物量隨之升高，當(dāng)pH值為7時(shí)，生物量達(dá)到最大，為1.202g/200mL；當(dāng)pH值為8時(shí)，生物量下降。通過(guò)分析可知，當(dāng)pH值為7時(shí)，花臉香蘑液體發(fā)酵生物量與pH值為5、6、8相比，達(dá)到顯著性差異。因此，在花臉香蘑液體發(fā)酵中，最佳pH值為7；其次pH值為6和8；pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使花臉香蘑菌絲體發(fā)酵生物量減小。

2.5無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體液體發(fā)酵的影響

無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體液體發(fā)酵的影響見(jiàn)圖5。

圖5　無(wú)機(jī)鹽對(duì)花臉香蘑液體發(fā)酵中生物量的影響Fig.5　The effect of inorganic salt on the biomass of mycelia in liquid fermentation

由圖5可知，無(wú)機(jī)鹽為CuSO4和FeSO4時(shí)，能明顯增加花臉香蘑菌絲液體發(fā)酵生物量，且兩者之間沒(méi)有顯著性差異。當(dāng)無(wú)機(jī)鹽為NiSO4時(shí)，與空白對(duì)照無(wú)顯著性差異。因此，在供試的無(wú)機(jī)鹽中，CuSO4和FeSO4能促進(jìn)花臉香蘑菌絲液體發(fā)酵生物量。

2.6菌齡對(duì)菌絲體液體發(fā)酵的影響

菌齡對(duì)菌絲體液體發(fā)酵的影響見(jiàn)圖6。

圖6　菌齡對(duì)花臉香蘑液體發(fā)酵中生物量的影響Fig.6　The effect of fungus ages on the biomass of mycelia in liquid fermentation

由圖6可知，在花臉香蘑菌絲液體發(fā)酵中，接種菌齡為4、8、12、16 d時(shí)，對(duì)菌絲體生物量沒(méi)有影響，之間無(wú)顯著性差異。

2.7菌絲體液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

在液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以碳源2 g/100 mL，氮源0.4 g/100 mL，無(wú)機(jī)鹽1.5×10-4g/100 mL，pH值及菌齡為因素，每個(gè)因素4個(gè)水平，使用L16（45）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。共有16個(gè)組合，每個(gè)組合設(shè)5個(gè)重復(fù)。正交試驗(yàn)L16（45）因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果及極差分析見(jiàn)表2。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果及極差值分析Table 2　The results and range of orthogonal experiment

根據(jù)極差分析，4種因素對(duì)花臉香蘑菌絲體生物量影響依次為A＞C＞B＞D＞E，碳源和pH對(duì)菌絲體干生物量影響最大，菌齡影響最小，不同氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體干生物量也有影響。分析結(jié)果表明：實(shí)際優(yōu)處理為A1B2C2D2E2；實(shí)際優(yōu)處理配方為碳源為土豆粉、氮源為KNO3、pH=6、無(wú)機(jī)鹽為CuSO4、菌齡為8 d；根據(jù)極差Tij的優(yōu)水平組合，提出干生物量預(yù)測(cè)優(yōu)處理為A1，B4，C3，D4，E3，預(yù)測(cè)優(yōu)處理配方為碳源為土豆粉、氮源為NH4Cl、pH=7、無(wú)機(jī)鹽為FeSO4、菌齡為12 d。當(dāng)用預(yù)測(cè)優(yōu)化處理配方進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所得生物量比實(shí)際優(yōu)化處理更大，達(dá)到1.8027 g/200 mL，因此，由實(shí)際優(yōu)處理和預(yù)測(cè)優(yōu)處理得出，液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源：土豆粉；氮源：NH4Cl；pH7；無(wú)機(jī)鹽為FeSO4；菌齡12 d。

3　結(jié)論

花臉香蘑菌絲在CPDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，粗壯。菌絲在前3天生長(zhǎng)較慢，后逐漸加快，進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，在11 d到13 d時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率達(dá)到最大。

探討了花臉香蘑菌絲體發(fā)酵生物量的主要因素有：碳源、氮源、pH值、無(wú)機(jī)鹽以及菌齡，并且確定了單因素試驗(yàn)的最佳水平，通過(guò)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花臉香蘑菌絲體液體發(fā)酵最佳碳源為土豆粉；最佳氮源為NH4Cl；最佳pH值為7；無(wú)機(jī)鹽為CuSO4和FeSO4；菌齡菌絲體生物量沒(méi)有影響。

通過(guò)正交試驗(yàn)表明，優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基為：碳源為土豆粉、葡萄糖；氮源為NH4Cl；pH值為7；無(wú)機(jī)鹽為FeSO4；菌齡為12 d。

［1］卯曉嵐.中國(guó)大型真菌［M］.鄭州：河南科技出版社，2000：177-180

［2］Mazur X，backer U，Anke T，et al.Two new bioactive diterpenes from Lepista sordida［J］.Phytochemistry，1996，43（2）：405-407

［3］肖玉珍，趙靜珍.花臉蘑（Lepista Sordida）人工馴化栽培技術(shù)的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26（1）：7-12

［4］羅心毅，洪江，張勇民.花臉香蘑元素測(cè)定［J］.中國(guó)食用菌，2003，22 （4）：43-44

［5］羅心毅，洪江，張勇民.人工栽培花臉香蘑氨基酸研究［J］.氨基酸與生物資源，2003，25（3）：14-15

［6］申慧彥，劉朝貴.花臉蘑菌絲營(yíng)養(yǎng)特性的研究［J］.食用菌，2003（3）：5-6

［7］孟玲，王麗華，王蘭英，等.花臉香蘑菌絲體發(fā)酵條件的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32（6）：121-125

［8］胡先運(yùn).花臉香蘑田間栽培、營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)及液體發(fā)酵特性研究［D］.貴陽(yáng)：貴州師范大學(xué)，2007：40-50

［9］羅倩，王瑩，張林.貴州花臉香蘑HL-07液體發(fā)酵條件優(yōu)化研究［J］.種子，2015，34（5）：88-91

Study on Liquid Fermentation of Lepista sordida Mycelia

HU Xian-yun，JIANG Jia-zhi （Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，Guizhou，China）

The liquid fermentation medium of Lepista sordida was optimized.We optimized carbon sources，nitrogen sources，pH，inorganic salt，fungus ages in medium with the biomass of mycelia as determining parameter by single factor analysis.The results showed that the best carbon source was to be the potato flour，the best nitrogen source was to be NH4Cl，the best pH was to be 7，the best inorganic salt was to be CuSO4and FeSO4in liquid fermentation medium.Meanwhile，the optimized of medium for liquid fermentation of Lepista sordida was screened through orthogonal experiment methods.The optimized formula of liquid fermentation medium were contained that carbon source was potato flour，nitrogen source was NH4Cl，pH=7，and inorganic salt was FeSO4，fungus ages was at 12 d.

Lepista sordida；mycelia；fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.044

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21545006）；貴州省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015GZ48861）；貴州省教育廳科研基金項(xiàng)目（黔教科20090114）；黔南醫(yī)?？蒲谢鹬攸c(diǎn)項(xiàng)目（QNYZ200905，QNYZ201601）

胡先運(yùn)（1981—），男（漢），副教授，在讀博士，研究方向：生物化學(xué)教學(xué)及研究。

2015-08-06