幾種耐高溫淀粉酶的酶活影響因素研究

鄭美娟，郭金玲，余華順，姚鵑，龔大春，*（.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌44300；.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌44300）

幾種耐高溫淀粉酶的酶活影響因素研究

鄭美娟1，郭金玲1，余華順2，姚鵑2，龔大春1，*
（1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌443002）

淀粉酶是食品、發(fā)酵行業(yè)應(yīng)用最廣泛的酶種之一。從最適溫度、最適pH值、保存溫度、緩沖溶液pH值等方面對(duì)5種不同的耐高溫α-淀粉酶酶活的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：耐高溫α-淀粉酶B的耐酸性最好，在pH4.00～7.50之間，相對(duì)酶活為98%～100%；耐高溫淀粉酶A的耐高溫性最好，在反應(yīng)溫度70℃～100℃之間，相對(duì)酶活為100%～121%；耐高溫α-淀粉酶A的緩沖溶液穩(wěn)定性最好，在緩沖溶液pH4.50～7.00之間，酶活維持在91%～100%；耐高溫α-淀粉酶E溫度穩(wěn)定性質(zhì)最好，在儲(chǔ)存溫度30℃～60℃之間，相對(duì)酶活為98%～100%。為淀粉酶的選擇奠定基礎(chǔ)。

耐高溫α-淀粉酶；酶活；影響因素

α-淀粉酶是目前國際市場(chǎng)上非常熱門的酶制劑之一，被廣泛應(yīng)用于淀粉加工、酒精制造、味精、醬油、造紙等行業(yè)。近年來，隨著現(xiàn)代工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，以淀粉為原料的成品愈來愈多，淀粉原料在深加工中所處的反應(yīng)環(huán)境也變得苛刻，如高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等［1-3］。原有的淀粉酶會(huì)造成原料的利用率低，化學(xué)工藝復(fù)雜，下游處理繁瑣等。因此開發(fā)新型的耐酸性高溫α-淀粉酶具有重要的前景意義［4-9］。目前市場(chǎng)的行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者是美國的杰能科和丹麥諾維信α-淀粉酶產(chǎn)品，酶活高且對(duì)工業(yè)生產(chǎn)的各種酸環(huán)境和高溫都能有很強(qiáng)的耐受性。我國市場(chǎng)上的α-淀粉酶的種類繁多，但是品質(zhì)參差不齊，在液化和糖化的效果上與國際主流的幾個(gè)淀粉酶制劑公司差距較大，因此對(duì)市場(chǎng)上的耐酸性高溫α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，能夠清楚了解整個(gè)α-淀粉酶行業(yè)的現(xiàn)狀，對(duì)企業(yè)菌種的研發(fā)，淀粉酶的生產(chǎn)，合理的銷售目標(biāo)，準(zhǔn)確的市場(chǎng)定位均具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1試劑及儀器

A、B、C、D、E、F公司的耐酸性高溫α-淀粉酶、淀粉、醋酸（分析純AR）、十二水磷酸氫二鈉（分析純AR）、檸檬酸（分析純AR）、碘化鉀（分析純AR）、0.1 mol/L鹽酸、0.1 mol/L氫氧化鈉（分析純AR）、無水乙醇（分析純AR）、考馬斯亮藍(lán)（分析純AR）、牛血清蛋白：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

20RP-52D自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；NH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；pHS-25酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；ZD-2型自動(dòng)電位滴定儀：上海雷磁儀器廠；TG16A-WS離心機(jī)：上海盧湘儀器廠；721W型分光光度計(jì)：上海儀器分析廠。

1.2方法

1.2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，然后用無離子水補(bǔ)充到1 mL，最后每支試管加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，每次添加之后立即用漩渦混合器振蕩混合，反應(yīng)5 min后在595 nm波長(zhǎng)的分光光度計(jì)測(cè)量其吸光值，空白對(duì)照為含0.0 mL的牛血清蛋白試管。

1.2.2酶液蛋白質(zhì)含量測(cè)定

準(zhǔn)確稀釋酶液，使吸光值在合理的區(qū)間（0.100～0.768），吸取1.00 mL的稀釋酶液，加入5.00 mL的考馬斯亮藍(lán)染料試劑，空白樣加1.00 mL雙蒸水和5.00 mL的考馬斯亮藍(lán)染料試劑，在5 min～10 min內(nèi)在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。

1.2.3耐酸性高溫α淀粉酶酶活測(cè)定

耐酸性高溫α淀粉酶酶活采用分光光度法測(cè)定。

1.2.4α-淀粉酶理化性質(zhì)研究方法

1.2.4.1pH值穩(wěn)定性

設(shè)計(jì)酶液 pH值梯度為 4.00、4.50、5.00、5.50、6.50、7.00、7.50。取耐酸性高溫淀粉酶約40 mL，分別用20%的乙酸和0.01 mol/L的氫氧化鈉調(diào)制酶液至所需pH值，置于30℃保存18 h后稀釋國標(biāo)檢測(cè)酶活。計(jì)算酶活力收率。

1.2.4.2最適反應(yīng)溫度

最適反應(yīng)溫度設(shè)計(jì)梯度為60、70、80、90、95、100℃，將酶液在pH為6.0的緩沖溶液中，在梯度溫度下進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算酶活力收率。

1.2.4.3最適作用pH值

用十二水合磷酸氫二鈉、檸檬酸配置緩沖溶液，pH值梯度為4.50、5.00、5.50、6.00、6.50、7.00，采用國標(biāo)檢測(cè)酶活。

1.2.4.4溫度穩(wěn)定性

取適量的樣品在試驗(yàn)梯度為40、45、50、60℃溫度下保存3 d，采用國標(biāo)檢測(cè)酶活，計(jì)算酶活收率。、

1.2.5酶活測(cè)定步驟

1）吸取可溶性淀粉溶液20.0 mL于試管中，加入磷酸緩沖液5.00 mL，搖勻后，于70℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min

2）加入稀釋好的待測(cè)酶液1.00 mL，立即計(jì)時(shí)搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5 min

3）反應(yīng)時(shí)間終止，立即吸取反應(yīng)液1.00 mL，加入到預(yù)先盛有0.5 mL鹽酸溶液和5.00 mL稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5 mL的鹽酸和5.00 mL稀碘液的作為空白樣，于660 nm波長(zhǎng)下，用比色皿迅速測(cè)定器吸光度A，根據(jù)吸光度表求得測(cè)試酶的濃度C。

酶活：耐高溫α-淀粉酶X=C×n/16.67

式中：C為測(cè)試酶液的濃度，μ/g；n為樣品的稀釋倍數(shù)；16.67為根據(jù)酶活定義計(jì)算的換算系數(shù)。

1.3蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用SDS-PAGE電泳測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。

2　結(jié)果與結(jié)論

2.1不同pH值對(duì)淀粉酶活性影響

不同的pH值對(duì)淀粉酶活的影響見圖1。

將這6種耐酸性高溫α-淀粉酶在pH值梯度4.00～7.50的酶活變化總結(jié)在一個(gè)表中可以清楚的了解各種酶之間對(duì)耐酸性的程度大小。其中B、C、D這3種酶的耐酸性都強(qiáng)，普遍的適合淀粉生產(chǎn)的強(qiáng)酸環(huán)境，A、E、F這3種酶在pH5.00以下的環(huán)境中酶活影響較大，不太適合更強(qiáng)酸環(huán)境的生產(chǎn)中使用。

3.2最適反應(yīng)溫度

不同溫度對(duì)淀粉酶酶活的影響見圖2。

由圖2可知，這幾種高溫淀粉酶，在70℃之前，溫度對(duì)酶活的影響基本相同，但是在70℃以后，溫度對(duì)酶的影響漸漸呈現(xiàn)出來，A、F這兩種酶在高溫的環(huán)境中更能發(fā)揮催化作用，酶活能超過國標(biāo)中測(cè)定的酶活，在淀粉酶的液化當(dāng)中，可以更加的發(fā)揮作用；B、C、D、E這幾種酶在高溫的時(shí)候，酶活下降的趨勢(shì)都比較明顯，有些的變化趨勢(shì)和中溫淀粉酶的趨勢(shì)一樣，在實(shí)際的生產(chǎn)中，要達(dá)到同樣的液化效果，所需要的酶劑量要更大。

圖1　不同的pH對(duì)淀粉酶活的影響Fig.1　The effect of different pH on the enzymatic activity of amylase

圖2　不同溫度對(duì)淀粉酶酶活的影響Fig.2　The effect of different temperature on the enzymatic activity of amylase

3.3緩沖溶液對(duì)酶活的影響

緩沖溶液的不同pH對(duì)各種酶活的影響見圖3。

圖3　 緩沖溶液的不同pH值對(duì)各種酶活的影響Fig.3　The effect of different pH on the enzymatic activity of amylase in buffer solution

緩沖溶液時(shí)保證反應(yīng)的的時(shí)候，整個(gè)反應(yīng)液體系中pH穩(wěn)定性，如圖3所示，F(xiàn)酶活在緩沖溶液的低pH值的時(shí)候有較大的影響，B、C、D、E這4種酶活在6.5～7.00區(qū)間內(nèi)，酶活有較大幅度的下降，其中的具體原因有待研究。

3.4保存溫度對(duì)酶活的影響

保存溫度對(duì)各種酶活的影響見圖4。

圖4　 保存溫度對(duì)各種酶活的影響Fig.4　The effect of the storage temperature on the enzymatic activity of amylase

由圖4分析可知，溫度對(duì)各種酶活的影響均不同，在45℃以下酶活均為出現(xiàn)較大的變化。但是在此之后，各種酶由于本身的特性，酶活開始出現(xiàn)下降，特別是A、B酶，保存溫度對(duì)其酶活的影響較大。因此，為了防止α-耐酸性高溫淀粉酶的熱變性，應(yīng)該放置低溫保存。

3.5耐酸性高溫淀粉酶中蛋白質(zhì)的含量

3.5.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖5　 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5　The standard curve of the protein

由圖5可見，蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線呈一條直線，曲線方程為：y=0.505 4x+0.025 6，R2=0.995 6，在蛋白濃度為0～1.0g/L范圍內(nèi)時(shí)，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，顯色后的光吸收值OD595，線性增加，因此當(dāng)測(cè)定溶液中蛋白濃度時(shí)，只要顯色后的光吸收值OD595在圖中的直線范圍內(nèi)就可以參照標(biāo)準(zhǔn)曲線比較準(zhǔn)確的計(jì)算出被測(cè)溶液的淀粉濃度。

3.5.2A、B、C、D、E、F酶中蛋白質(zhì)的測(cè)定酶液蛋白質(zhì)含量見表1。

表1　酶液蛋白質(zhì)含量Table 1　The contain of the protein in the enzymatic liquid

結(jié)合各公司的酶活，可以知道酶活的高低和酶含量沒有太多的關(guān)聯(lián)，可推測(cè)在提取酶液的工藝中不需要追求單位內(nèi)的酶活大小而特意濃縮酶液，酶的活力的大小與酶的結(jié)構(gòu)和催化位點(diǎn)決定酶活大小。

4　結(jié)論

對(duì)A、B、C、D、E、F公司耐酸性高溫α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，這6種酶的理化性質(zhì)有共同的特征，也有不相同的特征。各種酶對(duì)耐酸性、耐高溫性、保存的溫度環(huán)境，反應(yīng)體系液體的緩沖pH表現(xiàn)出來的酶活穩(wěn)定差異性較大，這決定了在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)所使用的領(lǐng)域不同。B公司的耐酸性高溫α-淀粉酶的耐酸性最好，在pH4.00～7.50之間，相對(duì)酶活為98%～100%；A公司的耐酸性高溫淀粉酶的耐高溫性最好，在反應(yīng)溫度70℃～100℃之間，相對(duì)酶活為100%～121%；A公司的耐酸性高溫α-淀粉酶的緩沖溶液穩(wěn)定性最好，在緩沖溶液pH4.50～7.00之間，酶活維持在91%～100%；E公司的耐酸性高溫α-淀粉酶溫度穩(wěn)定性質(zhì)最好，在儲(chǔ)存溫度30℃～60℃之間，相對(duì)酶活為98%～100%；E公司的蛋白純化最好，單位蛋白酶活相對(duì)最高。

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Study on the Enzymatic Activity Effects of Several Thermostable α-Amylases

ZHENG Mei-juan1，GUO Jin-ling1，YU Hua-shun2，YAO Juan2，GONG Da-chun1，*
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical，Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China；2.Yeast Function of Hubei Key Lab.，Angel Yeast Co.，Ltd.，Yichang 443002，Hubei，China）

α-Amylase is one of the most extensive enzyme for food and fermentation industry.Several thermostable α-Amylase enzymatic activity effect was studied from the optimal temperature，the optimal pH，the storage temperature and buffer solution pH.The results showed that B company's thermostable α-Amylase acid resistance was preferably with the relative activity of 98%to 100%between 4.00-7.50 pH and A company's thermostable amylase temperature resistance was the best with the relative activity 100%to 121%between 70℃-100℃and the thermostable α-Amylase of Company A buffering ability was the best in a buffer solution pH value between 4.50-7.00 with the activity from 91%to 100%and the E company's α-Amylase have the best temperature stability from 30℃to 60℃storage temperature with the relative activity of 98%to 100%. This research will provide the basis for the select of α-Amylase.

thermostableα-Amylase；enzymaticactivity；effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.013

鄭美娟（1977—），女（漢），講師，碩士研究生，從事生物學(xué)的教學(xué)與研究。

龔大春（1967—），教授，博士，從事生物催化與生物能源的研究與開發(fā)。

2015-08-25