葛根多糖的基本理化特性研究

陳兵兵，王振斌（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

葛根多糖的基本理化特性研究

陳兵兵，王振斌*
（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

為了研究葛根多糖的基本理化特性，采用脫脂脫蛋白后的葛根多糖過DEAE-52纖維素柱得到的樣品PS-D1、PS-D2、PS-D3為原料，研究3組樣品的分子量分布，基本外貌形態(tài)，剛果紅反應(yīng)和體外抗氧化的測定。結(jié)果表明：3種組分的分子量分散系數(shù)比較集中，分別為1.4、1.9和1.4，外貌形態(tài)經(jīng)SEM掃描分析為纖維樹枝狀，片狀或碎屑狀堆積，剛果紅分析表明3種多糖不具有三螺旋結(jié)構(gòu)，在水溶液中表現(xiàn)為無規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象。體外抗氧化結(jié)果表明葛根多糖有較好的DPPH自由基的清除能力且它們的半抑制率IC50值分別為3.14、2.85、2.31 mg/mL，并且均含有一定的清除ABTS+自由基的能力，其中PS-D3的等價抗氧化能力（TEAC）最好，為（53.83 μmol Trolox/g樣品）。葛根多糖的基本理化特性研究為葛根的開發(fā)及綜合利用提供了理論參考。

葛根；多糖；理化特性；抗氧化

葛根（Pueraria）為豆科葛屬多年生落葉藤本植物的肥大塊根，是一種藥食兩用的植物。葛根可分為兩種，即粉葛和野葛。粉葛富含淀粉，是重要的食材及食品添加劑；野葛中富含異黃酮類、多糖類、氨基酸及微量元素等物質(zhì)，具有重要的藥理功能和藥用價值［1］。葛根在全國大部分地區(qū)都有分布［2］，具有清除自由基、抗人體衰老、抗凝血、降血糖等生理功能［3］，深受國內(nèi)外市場的歡迎，發(fā)展?jié)摿艽蟆?/p>

多糖是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。分子量從幾萬到幾千萬，具有許多生物活性，包括抗感染、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、降血糖、抗病毒等作用［4］。多糖廣泛存在于高等植物、動物細(xì)胞膜、微生物細(xì)胞壁中，不但是生物體的重要組成部分還參與多種生理功能。已有研究顯示葛根多糖具有抑菌作用［5］，且多糖的生物活性與多糖的結(jié)構(gòu)存在重要的構(gòu)效關(guān)系［6］。目前針對葛根的研究主要集中在葛根黃酮類物質(zhì)，而葛根多糖的一些研究較少報道，因此本文主要研究了葛根多糖的基本特性如分子量測定、掃描電鏡（SEM）、剛果紅等，并在最后對其體外抗氧化性進(jìn)行了分析，為葛根多糖的應(yīng)用提供了理論參考，提升了葛根的市場應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葛根：句容茅寶葛業(yè)有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、過硫酸鉀、1，1-二苯基-2-苦肼基、剛果紅、ABTS：美國sigma公司等。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1601型紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；Agilent 100型液相色譜：美國Agilent公司；DAWN HELEOS-Ⅱ型多角度光散射儀：美國Wyatt公司；DL-5C離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-8型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1多糖的提取與純化

葛根粉碎后過100目篩，稱取一定量葛根粉加石油醚脫脂處理。多次稱取脫脂后葛根20 g，按料液比1∶20（g/mL），在90℃條件下回流提取4 h，合并上清液，真空濃縮。并以Sevage法除蛋白，離心（4 500 r/min，10 min）去除有機(jī)相與水相交界處乳化層。合并上清液，加4倍的無水乙醇沉淀多糖，4℃靜置過夜，收集的沉淀物再用蒸餾水復(fù)溶，透析48 h后凍干得葛根粗多糖。取適量粗多糖用蒸餾水溶解過DEAE-52纖維素柱，分別以蒸餾水、0.1 mol/L和0.2 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫得PS-D1、PS-D2、PS-D3 3種組分。

1.3.2多糖分子量的測定

采用尺寸排阻色譜和多角度激光光散射聯(lián)用測定分子量和分子量分布。色譜柱采用DB-806～805 MHQ串聯(lián)型（DB-806 MHQ，8 mm Ф×30 cm，shodex，Japan）水相柱，尺寸排阻色譜裝置采用WATERS 1515型泵和示差折光檢測器。樣品用0.1 mol/L的氯化鈉溶液配置成1.0mg/mL的多糖溶液，柱溫25℃，進(jìn)樣量100μL，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣前過0.22 μm膜處理，流動相為0.1 mol/L氯化鈉溶液。

1.3.3多糖的掃描電鏡（SEM）觀察［7］

將充分干燥精制的葛根多糖用離子濺射鍍膜法制備電鏡樣品，置于掃描電鏡的樣品室中掃描分析，調(diào)節(jié)加速電壓15 kV，用隨機(jī)工作站進(jìn)行拍攝，觀察多糖表面的形態(tài)。

1.3.4剛果紅反應(yīng)

剛果紅與多糖的相互作用是通過多糖在不同溶液體系中與剛果紅反應(yīng)的最大吸收波長來評價的。分別取濃度為1.0 mg/mL等體積的多糖PS-D1、PS-D2、PS-D3溶液與91 μmol/L的剛果紅溶液混合，然后加入4.0 mol/L NaOH溶液充分混合，使溶液中NaOH濃度在0～0.5 mol/L范圍內(nèi)變化。在400 nm～700 nm波長范圍內(nèi)用紫外-可見分光光度計進(jìn)行掃描，測定不同NaOH濃度條件下的最大吸收波長，以蒸餾水作為空白。

1.3.5DPPH自由基清除率的測定

采用文獻(xiàn) ［8］方法并加以部分修改。取1 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液分別加入到3 mL不同濃度的多糖樣品液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）中，暗處反應(yīng)30 min后于517 nm條件下測其吸光值，以VC作為陽性對照組。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0以去離子水為空白對照時的吸光值；A1為含樣品和DPPH時的吸光值；A2為含樣品和去離子水時的吸光值。

1.3.6等價抗氧化能力（TEAC）測定［9］

ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS+·，向其中加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，然后在ABTS+·這種自由基的最大吸光波長下檢測吸光度的變化，與Trolox的對照標(biāo)準(zhǔn)體系比較，換算出被測物質(zhì)總的抗氧化能力。

稱取過硫酸鉀13.2 mg加入到20 mL已配制好的7.4 mmol/L的ABTS溶液中，暗處攪拌12 h～16 h，然后用pH為7.4的PBS緩沖液稀釋至在734 nm處吸光值為0.70的溶液。取100 μL樣品液加入到3.90 mL已反應(yīng)完的ABTS溶液中，室溫20 min后于734 nm測其吸光值A(chǔ)。樣品的清除自由基能力按照方程（2）計算。

式中：A為ABTS溶液中有樣品時的吸光值；A0為ABTS溶液中不存在樣品時的吸光值。

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以不同濃度的Trolox溶液為樣品按照上述方法操作，制作Trolox清除率和其濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1　Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of Trolox

2　結(jié)果與分析

2.1葛根多糖的純化制備

葛根多糖的洗脫曲線如圖2所示。

圖2　葛根多糖的洗脫曲線Fig.2　The elution curve of polysaccharide from Pueraria

根據(jù)洗脫曲線分別收集主峰管中的樣品，濃縮透析凍干得到3種組分PS-D1、PS-D2、PS-D3，其得率分別為23.14%、47.52%和10.17%。

葛根多糖的全波長掃描如圖3所示。

圖3　 葛根多糖的全波長掃描Fig.3　The full wavelength scanning of polysaccharide from Pueraria

從圖3可知，葛根多糖樣品在280 nm和260 nm波長處無吸收，表明其不含蛋白、多肽及核酸。在520 nm波長處無吸收，表明其不含色素類物質(zhì)［10］。

2.2分子量的測定

葛根多糖的分子量如表1所示。

表1　 葛根多糖的分子量Table 1　Molecular weight of polysaccharide from Pueraria

由表1可以看出樣品PS-D3的分子量較大，分散性指數(shù)較小，3種組分的多糖分散性指數(shù)都較小表明這3種組分的多糖分子量比較集中。

2.3表觀形貌結(jié)果

利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察葛根多糖PS-D1、PS-D2和PS-D3的固態(tài)表觀形貌如圖4～圖6所示。

圖4　PS-D1掃描電鏡照片F(xiàn)ig.4　The scanning electron microscope photos of PS-D1

圖5　PS-D2掃描電鏡照片F(xiàn)ig.5　The scanning electron microscope photos of PS-D2

圖6　PS-D3掃描電鏡照片F(xiàn)ig.6　The scanning electron microscope photos of PS-D3

PS-D1和PS-D2呈纖維樹枝狀，可能是由于許多分子或分子集團(tuán)聚集成不同樣式的束所致，PS-D1所形成的束大部分比PS-D2的細(xì)一些。此外多糖分子間存在大量的無規(guī)則交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表明結(jié)構(gòu)中存在較強(qiáng)的分子間相互作用。PS-D3呈片狀或碎屑狀堆積，表面形貌光滑，即多糖存在一定的聚集體，分子的規(guī)整性不強(qiáng)，當(dāng)放大倍數(shù)達(dá)到1000倍時可以看到含有聚集態(tài)乳狀結(jié)構(gòu)。

2.4剛果紅分析

葛根多糖與剛果紅溶液混合物隨NaOH濃度變化而表現(xiàn)出來的最大波長的變化如圖7所示。

圖7　不同NaOH濃度下多糖與剛果紅的最大吸收波長Fig.7　The maximum absorption wavelength of polysaccharide with Congo red under different NaOH concentrations

從圖7中可以看出，隨著NaOH濃度的增大，多糖-剛果紅溶液的最大吸收波長均呈現(xiàn)減小的趨勢，表明這3種組分的多糖不具有三螺旋結(jié)構(gòu)，在水溶液中表現(xiàn)為無規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象。

2.5DPPH自由基的清除

DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時，DPPH的單電子被配對，顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，且這種顏色的變淺程度與配對電子數(shù)成劑量關(guān)系。因此，可通過測定此波長處的吸光度來評價自由基的清除情況，從而評價樣品的抗氧化能力，樣品的抗氧化能力以清除率表示，清除率越大，抗氧化性越強(qiáng)。

3種組分的多糖對DPPH自由基清除能力如圖8所示。

從圖8中可以看出，3種多糖均具有很好的DPPH自由基的清除能力，隨著樣品濃度的增大清除效果也在增加，且PS-D1、PS-D2和PS-D3的半抑制率IC50值分別為3.14、2.85 mg/mL和2.31 mg/mL，VC的半抑制率IC50值為0.26 mg/mL，其中PS-D3的IC50值和VC的較為接近，表現(xiàn)出較好的清除效果。

2.6等價抗氧化能力（TEAC）

ABTS+·是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，所測試的樣品抗氧化能力越強(qiáng)其提供電子的能力就越強(qiáng)，可以通過測定反應(yīng)液的吸光度的變化直接反應(yīng)樣品的抗氧化能力。

圖9為葛根多糖PS-D1、PS-D2和PS-D3的TEAC值。

圖8　多糖PS-D1、PS-D2和PS-D3的DPPH自由基清除能力Fig.8　Antioxidant activities of PS-D1，PS-D2 and PS-D3 by scavenging ability on DPPH

圖9　多糖PS-D1、PS-D2和PS-D3等價抗氧化值Fig.9　TEAC assays of PS-D1，PS-D2 and PS-D3

從圖9中可以看出3種組分的多糖均含有一定的清除ABTS+自由基的能力，且0.2 mol/L NaCl洗脫組分多糖PS-D3的TEAC值最大（53.83 μmol Trolox/g樣品）。

3　結(jié)論

針對不同洗脫液洗脫收集的樣品PS-D1、PS-D2 和PS-D3，它們的分子量分散系數(shù)分別為1.4、1.9和1.4，3種組分的多糖分子量比較集中，為以后研究構(gòu)效關(guān)系奠定了理論基礎(chǔ)。掃描電鏡結(jié)果首次揭示了葛根多糖的基本形態(tài)外貌，PS-D1和PS-D2呈纖維樹枝狀，可能是由于許多分子或分子集團(tuán)聚集成不同樣式的束所致，PS-D1所形成的束大部分比PS-D2的細(xì)一些。PS-D3呈片狀或碎屑狀堆積，表面形貌光滑，即多糖存在一定的聚集體，分子的規(guī)整性不強(qiáng)，當(dāng)放大倍數(shù)達(dá)到1000倍時可以看到含有聚集態(tài)乳狀結(jié)構(gòu)。剛果紅結(jié)果分析表明這3種組分的多糖不具有三螺旋結(jié)構(gòu)，在水溶液中表現(xiàn)為無規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象。體外抗氧化結(jié)果可以看出3種組分多糖均具有很好的DPPH自由基的清除能力，隨著樣品濃度的增大清除效果也在增加且PS-D1、PS-D2和PS-D3的半抑制率IC50值分別為3.14、2.85 mg/mL和2.31 mg/mL，且均含有一定的清除ABTS+自由基的能力，0.2 mol/L NaCl洗脫組分多糖PS-D3的TEAC值最大（53.83 μmol Trolox/g樣品）。葛根多糖的基本理化特性研究結(jié)果可以很好的為葛根的開發(fā)及綜合利用提供理論參考，體外抗氧化活性的分析可以指導(dǎo)葛根多糖在生物醫(yī)療上的應(yīng)用。

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Study on the Basic Physical and Chemical Properties of Polysaccharide from Pueraria

CHEN Bing-bing，WANG Zhen-bin*
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China）

In order to study the basic physical and chemical properties of the polysaccharides from Pueraria，the raw material PS-D1，PS-D2 and PS-D3 were obtained from the samples obtained from the DEAE-52 cellulose column after defatted and deproteinized.The molecular weight distribution，the basic form of appearance，Congo red and anti-oxidation in vitro assays were studied.The results showed that：the molecular weight of the three components of the dispersion coefficient was relatively concentrated，respectively，1.4，1.9 and 1.4.The morphology of the surface was analyzed by SEM scanning，which was fibrous，patchy or debris，Congo red analysis showed that the polysaccharides without three helix structure，in aqueous solution was a random coil chain conformation.The antioxidant results showed that polysaccharide had a better DPPH radical scavenging ability and their half inhibition rate IC50values were 3.14，2.85 and 2.31 mg/mL，respectively.And they contained the ability of scavenging free radicals ABTS+，which PS-D3 equivalent antioxidant capacity（TEAC）was the best of 53.83 μmol Trolox/g sample.The study of the basic physical and chemical properties of the polysaccharide from the Pueraria provided the theoretical basis for the development and comprehensive utilization of the Pueraria.

Pueraria；polysaccharide；physicalandchemicalproperties；anti-oxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.003

國家級星火計劃（2013GA690310）；江蘇省科技支撐計劃（NY2012013，GY2012021）

陳兵兵（1990—），男（漢），在讀碩士研究生，主要研究生物活性物質(zhì)。

王振斌（1975—），男（漢），教授，博士生導(dǎo)師，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品生物加工技術(shù)研究。

2015-08-28