茶多酚對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2增殖、凋亡的影響及其機(jī)制探討

田夢(mèng)秋，劉堅(jiān)，鄭家法

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽(yáng) 421002)

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茶多酚對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2增殖、凋亡的影響及其機(jī)制探討

田夢(mèng)秋，劉堅(jiān)，鄭家法

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽(yáng) 421002)

目的觀察茶多酚對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2增殖、凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。方法培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，加入不同濃度的茶多酚共育，比較細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞核形態(tài)，并比較細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果茶多酚可抑制Hep-2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡，上調(diào)Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，且呈濃度依賴性(P均<0.05)。結(jié)論茶多酚能抑制Hep-2細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)上調(diào)和Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

茶多酚；喉癌；Caspase-3蛋白；Bax蛋白；Bcl-2蛋白

近年來(lái)，喉癌的發(fā)病率有逐年遞增的趨勢(shì)，是耳鼻咽喉頭頸外科常見(jiàn)惡性腫瘤之一。喉癌的主要治療手段以手術(shù)和放療為主，化療作為支持或輔助治療，但手術(shù)治療存在較高的致殘率，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，而近年實(shí)施的誘導(dǎo)化療后續(xù)同步放化療或手術(shù)綜合治療模式可明顯改善患者生活質(zhì)量[1]。茶多酚是從綠茶中提取的多酚類(lèi)化合物，具有抗癌、防癌、抗氧化等多種藥理作用[2]，其機(jī)制可通過(guò)抑制基因表達(dá)、相關(guān)酶的活性及提高機(jī)體免疫功能和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式來(lái)實(shí)現(xiàn)[3]。研究[4～8]表明，茶多酚對(duì)肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌等腫瘤具有明顯的抑制作用，且無(wú)明顯不良反應(yīng)，但是有關(guān)茶多酚殺傷喉鱗癌細(xì)胞株的研究鮮有報(bào)道。本研究以人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2為研究對(duì)象，觀察不同濃度茶多酚對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1藥物、試劑及儀器茶多酚(上海源葉生物科技有限公司)。RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素(Hyclone公司)，小牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)，Cell Counting Kit-8 試劑盒(Dojindo公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche公司)，HRP標(biāo)記GAPDH單抗(上?？党缮锕こ逃邢薰?。3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)，5417R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorff公司)，SCV4A1型超凈工作臺(tái)(Esco公司)，-80 ℃超低溫冰箱(Forma公司)，酶標(biāo)儀(Thermo公司)，7300型定量PCR儀(ABI公司)

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞以含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2飽和濕度。

1.3Hep-2細(xì)胞增殖情況觀察采用CCK-8法檢測(cè)。Hep-2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，以1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度為1.0×106個(gè)/mL，以200 μL/孔接種于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，各孔分別加入含有相應(yīng)濃度茶多酚(0、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL，分別計(jì)為A、B、C、D、E、F、G、H組)和順鉑(2 μg/mL，I組)的培養(yǎng)基，恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，加入10 μL的CCK-8試劑孵育4 h，取波長(zhǎng)為450 nm，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，試驗(yàn)重復(fù)3次，所得結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并取平均值計(jì)算抑制率[9]，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-待測(cè)孔平均吸光度值/對(duì)照孔平均吸光度值)×100%。

1.4Hep-2細(xì)胞胞核形態(tài)觀察采用Hoechst33258熒光染色法。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞混懸液，接種于置有無(wú)菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為1.5×105/孔，37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁爬滿蓋玻片80%左右時(shí)，添加茶多酚，使茶多酚終濃度為0、40、160、320 μg/mL(分別計(jì)為A、B、C、D組)。24 h后棄培養(yǎng)液，1×PBS清洗3次，每孔加入0.5 mL的4%多聚甲醛固定液固定，30 min后吸除固定液，并以1×PBS沖洗3遍，加入Hoechst33258熒光染色液染色9 min，吸水紙從邊緣吸除染色液，1×PBS清洗3次后自然晾干，中性甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5Hep-2細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA檢測(cè)采用RT-PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞，加入終濃度為0、40、160、320 μg/mL的茶多酚(分別計(jì)為A、B、C、D組)，共育24 h后，分別按照TRIzol Reageant試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)引物序列，GAPDH作為內(nèi)參照，ABI7300系統(tǒng)熒光定量PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為20 μL，包括：10 μL SYBR GreenⅠ核酸染料，上下游引物各1 μL，1 μL cDNA模板，7 μL去離子水。擴(kuò)增結(jié)束后收集溶解曲線，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用Livak(2-ΔΔCt)相對(duì)定量法計(jì)算各組Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖抑制率比較A、B、C、D、E、F、G、H、I組的24 h細(xì)胞增殖抑制率分別為0、3.64%、8.42%、15.80%、22.30%、33.40%、40.42%、51.00%、52.88%，48 h細(xì)胞增殖抑制率分別為0、8.56%、18.81%、30.36%、42.64%、51.81%、66.29%、79.41%、81.49%，C、D、E、F、G、H、I組各組間兩兩比較及各組分別與A組比較，P均<0.05。

2.2各組細(xì)胞核形態(tài)比較A組細(xì)胞核分布較均勻，呈圓形或橢圓形、細(xì)胞核膜完整；B組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核體積變小、核固縮、分布不均勻；C組細(xì)胞部分出現(xiàn)核碎裂、致密的藍(lán)色顆粒狀熒光、凋亡小體形成；D組細(xì)胞核碎裂、凋亡小體明顯增多。

2.3各組Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA比較Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA比較見(jiàn)表1。

表1　各組Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，﹟P<0.05。

3　討論

喉癌是源于喉黏膜上皮的惡性腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌多見(jiàn)，發(fā)病因素多與長(zhǎng)期吸煙、飲酒、病毒感染及吸入有害物質(zhì)等有關(guān)[10]，發(fā)病率居頭頸部惡性腫瘤的第三位[11]。由于解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，癥狀不典型，臨床上難以早期診斷，且易并發(fā)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此治療效果欠佳，預(yù)后差。目前，喉癌的主要治療原則為外科手術(shù)根治切除加放療、化療等輔助治療，常規(guī)化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，亦損傷增殖活躍的正常組織干細(xì)胞，引起骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)[12]，嚴(yán)重?fù)p傷患者生活質(zhì)量，甚至影響治療進(jìn)程。

茶葉在自然界中廣泛存在，容易獲取并且成本低廉。茶多酚是從茶葉中(尤其是綠茶)提取的一種多酚類(lèi)化合物，主要由兒茶素、花色苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)等化學(xué)物質(zhì)組成，占茶葉干重的30%左右，茶多酚中所含某些礦物質(zhì)和維生素增加了茶的抗氧化能力等多種生物學(xué)活性及藥理效應(yīng)。茶多酚具有生物活性高、不易產(chǎn)生耐藥性、低毒的優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注，對(duì)茶多酚的研究與開(kāi)發(fā)也成為目前生物醫(yī)藥的熱點(diǎn)之一。研究[13]報(bào)道，茶多酚具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗輻射、防治動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物活性。

細(xì)胞凋亡主要有兩種啟動(dòng)途徑[14]：①線粒體/細(xì)胞色素c介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)途徑。其中促凋亡的Bax和抗凋亡的Bcl-2是其中的重要組成部分，Bax/Bcl-2的比值決定了線粒體膜的完整性及是否釋放細(xì)胞色素c，從而激活Caspase酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Caspase酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的最終效應(yīng)因子為Caspase-3[15]，當(dāng)其被激活后進(jìn)一步作用于底物，破壞DNA、抑制DNA修復(fù)和合成蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞核DNA碎片化而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]；②膜死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞外凋亡途徑。細(xì)胞受到內(nèi)外界因素刺激后，促進(jìn)膜死亡受體與Caspase家族前體蛋白結(jié)合，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3，降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究[17]證實(shí)，茶多酚能夠調(diào)控致癌物代謝酶類(lèi)活性變化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)調(diào)控相關(guān)受體而影響有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)，阻斷核基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖[18]。

本研究顯示，茶多酚可抑制Hep-2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡，上調(diào)Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，且呈濃度依賴性。提示茶多酚不僅能夠直接激活Caspase-3基因，而且能通過(guò)上調(diào)凋亡基因Bax、下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2，提高Bax/Bcl-2比值，激發(fā)Casepase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。

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Effects and mechanism of tea polyphenol on proliferation and apoptosis of human laryngeal cancer Hep-2 cells

TIAN Mengqiu, LIU Jian, ZHENG Jiafa

(The Affiliated Nanhua Hospital, University of South China, Hengyang 421002, China)

ObjectiveTo observe the effects of tea polyphenol (TP) on the proliferation and apoptosis of human laryngeal cancer Hep-2 cells, and to investigate its mechanism.MethodsThe Hep-2 cells were cultivated, and were treated with different concentrations of TP. The proliferation inhibition rate and the nuclear shape of Hep-2 cells were compared, and the relative expression of Caspase-3, Bax and Bcl-2 mRNA in cells was compared.Results TP inhibited the proliferation, induced apoptosis of Hep-2 cells, up-regualted the expression of Caspase-3 and Bax mRNA, and down-regulated the expression of Bcl-2 mRNA, which was in a dose-dependent manner. (all P<0.05). ConclusionsTP can inhibit the proliferation of Hep-2 cells, and induce its apoptosis. The mechanism may be related to the up-regulated expression of Caspase-3 and Bax mRNA and down-regulated expression of Bcl-2 mRNA.

tea polyphenol; laryngeal carcinoma; Caspase-3 protein; Bax protein; Bcl-2 protein

湖南省教育廳科研課題(15C1207)。

田夢(mèng)秋(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槎茄屎眍^頸外科的研究。E-mail: 65129946@qq.com

簡(jiǎn)介：鄭家法(1963-)，男，本科，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槎茄屎眍^頸外科的研究。E-mail: 13975466338@139.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.008

R739.65

A

1002-266X(2016)15-0027-03

2015-11-10)