NK細胞與早發(fā)型重度子癇前期疾病進展的相關(guān)性研究

趙秀伶　馬紅梅　馬　唯　單志娟　洛　麗

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院產(chǎn)科， 北京 101100； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院檢驗科， 北京 101100；3.首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院病理科， 北京 101100)

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· 臨床研究 ·

NK細胞與早發(fā)型重度子癇前期疾病進展的相關(guān)性研究

趙秀伶1*馬紅梅1馬唯1單志娟2洛麗3

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院產(chǎn)科， 北京 101100； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院檢驗科， 北京 101100；3.首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院病理科， 北京 101100)

目的 探討自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)與早發(fā)型重度子癇前期發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)關(guān)系。方法選取2012年1月至2014年12月在北京潞河醫(yī)院定期孕檢的重度子癇前期患者44例(早發(fā)型重度子癇前期20例,晚發(fā)型重度子癇前期24例)為研究對象。選取同時期正常無合并癥的患者20例為對照組。采集母親外周血2 mL，胎兒臍帶血2 mL及蛻膜組織。采用流式細胞學方法檢測外周血和臍帶血中的CD3-CD16-CD56+的百分率；蛻膜組織應用免疫組織化學方法，計算CD3-CD16-CD56+的數(shù)量取均值，應用計算機圖像分析法讀取CD56+細胞平均灰度值。結(jié)果重度子癇前期組外周血、臍血、蛻膜組織中的NK細胞數(shù)量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；早發(fā)型重度子癇前期組臍血、蛻膜組織中NK細胞數(shù)量高于晚發(fā)型重度子癇前期組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。重度子癇前期外周血、蛻膜組織中的NK細胞數(shù)量與病程進展呈負相關(guān)(r=-0.397，P=0.040；r=-0.391，P=0.044)，與血壓升高幅度呈正相關(guān)(r=-0.597，P=0.001；r=-0.416，P=0.031)。蛻膜組織中的NK細胞數(shù)量與確診重度子癇前期的孕周呈負相關(guān)(r=-0.594，P=0.003)。結(jié)論重度子癇前期患者外周血、臍血、蛻膜中NK細胞數(shù)量增加，早發(fā)型重度子癇前期增加更為顯著。外周血、蛻膜中NK細胞數(shù)量與早發(fā)型重度子癇前期的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

早發(fā)型重度子癇前期； 自然殺傷細胞； 蛻膜

妊娠期高血壓疾病是嚴重的妊娠期特發(fā)性疾病之一，嚴重威脅母兒生命。我國發(fā)生率9.4%～10.4%，國外7%～12%，其中早發(fā)型重度子癇前期(孕34周前)約占妊娠期高血壓疾病的0.9%[1]。妊娠期高血壓疾病對母嬰健康的危害以早發(fā)型重度子癇前期最為明顯。近年來對于早發(fā)型重度子癇前期的防治，是產(chǎn)科的熱點問題之一。自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)細胞可誘發(fā)子癇前期。但是NK細胞與子癇前期的病情嚴重程度，子癇前期的起始時間關(guān)系尚不明確。本研究通過早發(fā)型重度子癇前期NK細胞表達的水平，探討NK細胞與早發(fā)型重度子癇前期發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)關(guān)系，為NK細胞與子癇前期發(fā)病機制的研究提供實驗數(shù)據(jù)。

1　研究對象與方法

1.1研究對象

選取2012年1月至2014年12月在首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院產(chǎn)科門診定期孕檢的單胎重度子癇前期患者為研究對象，共納入研究44例(早發(fā)型重度子癇前期患者20例，晚發(fā)型重度子癇前期患者24例)。按照2∶1比例，選取同時期因臀位、骨盆狹窄等產(chǎn)科因素行剖宮產(chǎn)終止妊娠的患者20例為對照組。所有研究對象均排除合并慢性高血壓、糖尿病、宮內(nèi)感染、術(shù)前發(fā)熱、甲狀腺疾病、胎膜早破、自身免疫性疾病、腎炎及經(jīng)陰道分娩者。

1.2診斷方法

重度子癇前期的診斷按照謝幸等[2]主編的第8版《婦產(chǎn)科學》中妊娠期高血壓疾病的分類與臨床表現(xiàn)標準；根據(jù)發(fā)病時間早晚，將孕34周前診斷的重度子癇前期為早發(fā)型，孕34周后診斷的重度子癇前期為晚發(fā)型[1]。

1.3研究方法

采用前瞻性對照研究。研究對象入組后，確診重度子癇前期時，立即采集孕婦外周靜脈血(2 mL)，對照組入組時采集外周血，給予EDTA-K2抗凝，24 h內(nèi)經(jīng)流式細胞儀檢測CD3-CD16-CD56+的百分率。剖宮產(chǎn)術(shù)中新生兒娩出后立即留取臍帶血2 mL、給予EDTA-K2抗凝，24 h內(nèi)經(jīng)流式細胞儀檢測CD3-CD16-CD56+的百分率。胎盤娩出后30 min內(nèi)取胎盤母體面絨毛組織5～10塊, 約1 cm×1 cm×1 cm的組織, 置入10%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛溶液中固定24 h以上, 常規(guī)石蠟包埋, 連續(xù)切片,厚4 μm。采用免疫組織化學(SP)法, CD3、CD16、CD56單抗為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，工作濃度1∶100，每實驗切片高倍鏡下選取3個高倍視野，計數(shù)CD3-CD16-CD56+的量取均值。采用計算機圖像分析法計算CD56+細胞平均灰度值。所有胎盤送病理，排除宮內(nèi)感染。

1.4統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果

2.1重度子癇前期組與對照組患者一般情況的比較

3組患者年齡、孕產(chǎn)次、基礎(chǔ)平均動脈壓、術(shù)前白細胞計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；早發(fā)型重度子癇前期組孕期平均動脈壓升高幅度高于晚發(fā)型重度子癇前期組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.027)；病情進展速度即：血壓升高到確診重度子癇前期(preeclampsia PE)的時間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)；2組臨床表現(xiàn)(如以高血壓為主要表現(xiàn)/其他臟器損傷為主要表現(xiàn)所占比例、尿蛋白定量)比較，差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

2.2NK細胞比較

早發(fā)型重度子癇前期組、晚發(fā)型重度子癇前期組的外周血、臍血、蛻膜組織中CD3-CD16-CD56+細胞數(shù)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.067，P=0.000；F=7.400，P=0.002；F=8.986，P=0.000)。兩兩比較，早發(fā)型重度子癇前期組外周血、臍血、蛻膜組織中CD3-CD16-CD56+細胞數(shù)量高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義。早發(fā)型重度子癇前期組臍血及蛻膜組織中CD3-CD16-CD56+細胞數(shù)量高于晚發(fā)型重度子癇前期組，差異均有統(tǒng)計學意義(表2)。

應用計算機圖像分析法計算CD56+平均灰度值，3組CD56+平均灰度值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩兩比較，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表3。

2.3NK細胞與子癇前期相關(guān)性

外周血、蛻膜、臍血中NK細胞與重度子癇前期的病程進展速度及血壓升高幅度相關(guān)性分析：外周血和蛻膜組織中NK細胞數(shù)量與病程進展呈負相關(guān)(r=-0.397、r=-0.391)，與平均動脈壓升高幅度正相關(guān)(r=0.597、r=0.461)；蛻膜組織NK細胞數(shù)量與重度子癇前期確診孕周呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)：r=-0.594 ；臍血中NK細胞與重度子癇前期的病程進展、平均動脈壓升高程度、確診孕周無相關(guān)(表4)。

3　討論

妊娠子宮最主要的淋巴細胞是NK細胞源性的大顆粒細胞，占淋巴細胞的70%～80%。胎盤蛻膜表面局部浸潤的NK細胞可能來自于母體外周血NK細胞和胎兒肝臟趨化而來[3]。蛻膜中的NK細胞不同于外周血中的細胞，高表達CD56，主要表型為CD56+CD16-CD3-[4]。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell Ig-like receptor-2DL4, KIR2DL4)通過識別人類白細胞抗原-G (human leukocyte antigen-G, HLA-G)，向NK細胞傳遞抑制性信號，抑制NK細胞活性，保護滋養(yǎng)層細胞免受NK細胞殺傷作用，使母體對胚胎抗原免疫耐受并且控制滋養(yǎng)細胞的遷徙，調(diào)節(jié)淋巴細胞釋放細胞因子[5-7]發(fā)揮作用。

表1　3組一般情況比較

△1 mmHg=0.133 kPa.

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vslate onset preeclampsia group; NK: natural killer cell.

表3　胎盤蛻膜CD56+細胞平均灰度值比較

表4　重度子癇前期疾病進展與NK細胞的相關(guān)性

NK: natural killer cell; PE:preeclampsia.

蛻膜中的NK細胞能分泌大量的細胞因子，如：粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，干擾素、生長刺激因子-1、腫瘤壞死因子等[3]。干擾素-γ、干擾素-α具有組織滋養(yǎng)葉細胞遷移作用，引起胎盤淺著床、螺旋動脈重鑄受阻，誘發(fā)病理妊娠[8-9]。馬艷娟等[10]發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦HLA-G分子的表達明顯減少。李源等[11]的研究提示子癇前期患者胎盤組織KIR2DL4 mRNA表達明顯降低。HLA-G與KIR2DL4 mRNA低表達，對NK細胞的抑制作用減弱或消失，NK細胞數(shù)量增生，導致子癇前期。本研究中，重度子癇前期組外周血、臍血及蛻膜組織中NK細胞數(shù)量明顯高于正常對照組，提示NK細胞可能參與了重度子癇前期的發(fā)生。

盡管對于HLA在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中的作用也得到證實，但是HLA與重度子癇前期的嚴重程度以及發(fā)病時間的關(guān)系報道很少[13]。早發(fā)型重度子癇前期與晚發(fā)型重度子癇前期發(fā)病機制不同，母胎免疫耐受機制的破壞被認為是早發(fā)型重度子癇前期發(fā)病機制的關(guān)鍵。有學者[12]提出早發(fā)型子癇前期病變可能主要通過胎盤病變影響母體雙方疾病的發(fā)展，而晚發(fā)型子癇前期病變則為直接母體反應。本研究發(fā)現(xiàn)，早發(fā)型子癇前期組(<34周)蛻膜組織中NK細胞數(shù)量明顯高于晚發(fā)型子癇前期組(≥34周)，并且蛻膜組織中的NK細胞數(shù)量與確診子癇前期的時間呈負相關(guān)(r=-0.594)。推測蛻膜組織中的NK細胞的異常增生與重度子癇前期發(fā)病時間有關(guān)。但是NK細胞增生的速度、程度與重度子癇前期發(fā)病的關(guān)系還有待進一步的研究。

魏軍等[14-15]發(fā)現(xiàn)重度子癇前期患者血清在NK細胞作用下，血管內(nèi)皮細胞分泌血管收縮因子——內(nèi)皮素-1增多，分泌血管舒張因子——前列環(huán)素減少。病理學研究[16]也顯示，與晚發(fā)型子癇前期相比，早發(fā)型患者胎盤床面積減少，其胎盤的各級動靜脈血管管徑明顯變細。本研究中，早發(fā)型重度子癇前期患者的平均動脈壓升高幅度明顯高于晚發(fā)型重度子癇前期(P=0.027)，且外周血與蛻膜組織中的NK細胞數(shù)量與孕期血壓升高幅度呈正相關(guān)，考慮與NK細胞作用下血管內(nèi)皮細胞分泌的收縮血管物質(zhì)增多有關(guān)。由于血壓明顯升高，縮短了從出現(xiàn)臨床表現(xiàn)到確診重度子癇前期的時間。本研究提示外周血及蛻膜組織中NK細胞數(shù)量的增加與病程進展呈負相關(guān)。提示NK細胞可能對重度子癇前期疾病進展起作用。筆者推測早發(fā)型重度子癇前期血壓升高時，NK細胞水平可能已經(jīng)升高，加速了病程進展，因此NK細胞可能與早發(fā)型重度子癇前期的發(fā)生時間相關(guān)。

綜上所述，重度子癇前期患者外周血、臍血、蛻膜中NK細胞數(shù)量增加，早發(fā)型重度子癇前期患者增加更為顯著； NK細胞與早發(fā)型重度子癇前期的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但是由于本研究樣本量小，具有局限性，尚需大樣本研究進一步證實。

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編輯孫超淵

Study about the correlation of NK cell with early onset preeclampsia

Zhao Xiuling1*, Ma Hongmei1, Ma Wei1, Shan Zhijuan2, Luo Li3

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,BeijingLuheHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101100,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingLuheHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101100,China; 3.DepartmentofPathology,BeijingLuheHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101100,China)

ObjectiveTo study the correlation of natural killer cell (NK) to early onset preeclampsia. MethodsThis research adopts the case-control study. 44 preeclampsia patients who were regularly checked up in BeiJing LUHE hospital from Jan 2012 to Dec 2014 entered the research. The group included 20 early onset preeclampsia patients and 24 late onset preeclampsia patients. The control group was normal patients at the same period. Collecting maternal peripheral blood umbilical blood and deciduas. We test percentage of NK cell in peripheral and umbilical blood by Flow cytometry. NK cells in deciduas were tested by immunohistochemistry. ResultsThe courts of NK cells in maternal peripheral, umbilical blood and deciduas of early onset preeclampsia and late onset preeclampsia were all higher than those of the normal (P<0.05). It is significantly different. The counts of the NK cells in umbilical blood and deciduas were significantly higher than those of the late onset preeclampsia patients (P<0.05). The NK cell percentage in maternal peripheral blood in early onset preeclampsia patients were higher than in late onset preeclampsia patients.P<0.05. The courts of NK cells in maternal peripheral and deciduas was with negative correlation with course of preeclampsia.(r=-0.397，P=0.040；r=-0.391,P=0.044). It was positive correlation with the degree of elevation of pressure. (r=-0.597，P=0.001；r=-0.416,P=0.031). The courts of NK cells in deciduas was positive correlation with the time of diagnosis. (r=-0.594，P=0.003). ConclusionThe counts of the NK cell in maternal peripheral blood, umbilical blood and deciduas in preeclampsia patients were significantly higher than those of the control. Early onset severe preeclampsia increased significantly. NK cell in maternal peripheral blood and deciduas probably play a role in early onset preeclampsia.

early onset preeclampsia; Natural killer cell; deciduas

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.04.025]

R 71

2016-03-01)

*Corresponding author， E-mail：lhyyzxl@hotmail.com

網(wǎng)絡出版時間：2016-07-2021∶18網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160714.2118.054.html