大曲中高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育及其在綿柔型白酒丟糟中的應(yīng)用

楊建梅，王曉慧，王永偉，羅　霞

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

大曲中高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育及其在綿柔型白酒丟糟中的應(yīng)用

楊建梅，王曉慧，王永偉，羅霞

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

從大曲中篩選出了1株產(chǎn)纖維素酶能力較強的菌株，并通過連續(xù)誘變，獲得了1株高產(chǎn)纖維素酶誘變菌株RY49，利用RY49制備功能性纖維素酶簾子曲，與糖化酶、TH-AADY共同應(yīng)用于綿柔型白酒丟糟中進行入池二次發(fā)酵產(chǎn)酒，其出酒率（60%vol糟酒/100 kg丟糟）達到了3.89%，有效提升了丟糟的經(jīng)濟價值。

高產(chǎn)纖維素酶； 菌株； 誘變； 丟糟； 功能性簾子曲； 糖化酶； TH-AADY； 白酒

大曲中微生物種類豐富，數(shù)量繁多，主要有霉菌、酵母菌、細(xì)菌及放線菌四大類，其中以霉菌居首。在霉菌中，能產(chǎn)纖維素酶的菌類在發(fā)酵工業(yè)中也是一種較為重要的菌種，本實驗從大曲中采集多份樣品，以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源，采用水解圈法，旨在能篩選出1株分泌纖維素酶良好的絲狀真菌，以此進一步采用化學(xué)誘變方法，以甲基磺酸乙酯（EMS）為誘變劑，經(jīng)過剛果紅平板初篩和發(fā)酵測定酶活復(fù)篩，以期選育出1株產(chǎn)酶活較高的誘變菌株。

綿柔型大曲白酒在生產(chǎn)中會形成一定量的丟糟，丟糟中一般含有殘留淀粉9%～12%，一般酒企將丟糟直接廉價出售，這樣導(dǎo)致了丟糟中殘留淀粉的浪費。本實驗從丟糟殘留淀粉入手，利用選育的高產(chǎn)纖維素酶菌株制備功能性纖維素酶簾子曲，同時添加一定量的糖化酶和TH-AADY，進行丟糟入池二次發(fā)酵產(chǎn)酒，進一步降低殘留淀粉，提高丟糟的經(jīng)濟價值，本實驗旨在為丟糟再利用提供具有可行性的參考。

1　材料及方法

1.1材料及試劑

1.1.1材料

糖化酶，50000 U/g，無錫市雪梅酶制劑公司；安琪TH-AADY；麩皮；大曲，取自洋河酒廠；綿柔型丟糟，取自洋河酒廠。

1.1.2試劑

無水乙醇，羧甲基纖維素鈉，3，5-二硝基水楊酸，剛果紅，硝酸鈉，葡萄糖，氯化鉀，磷酸氫二鉀，硫酸亞鐵，硫酸鎂，瓊脂，氯霉素，氯化鈉，蔗糖，酒石酸鉀鈉，氫氧化鈉，無水亞硫酸鈉，檸檬酸，檸檬酸鈉，土豆。

1.2實驗方法

1.2.1高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育及其功能性簾子曲制備

1.2.1.1本研究采用以下工藝

大曲取樣→初篩→復(fù)篩→纖維素酶高產(chǎn)菌→連續(xù)誘變→突變菌株→傳代試驗穩(wěn)定性→斜面保藏→種曲培養(yǎng)→簾子曲培養(yǎng)制備

1.2.1.2工藝要點

（1）大曲采樣：從曲房中抽取30份大曲樣品，分別裝入無菌袋中，并儲存于4℃冰箱中備用。

（2）初篩：將所采樣品每份稱取5 g，在無菌條件下加入裝有45 mL無菌水的三角瓶中（其中三角瓶中裝有數(shù)粒玻璃珠），將三角瓶置于搖床上振蕩2 h，使其中的孢子充分振蕩打散后，靜置數(shù)小時，取上清液用無菌水稀釋，將稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6的樣品分別吸取0.2 mL涂布于準(zhǔn)備好的初篩平板上，倒置培養(yǎng)7 d，將初篩平板中的霉菌挑取到察氏培養(yǎng)基上進行劃線分離，得到單菌落，將純化后的霉菌點接到初篩培養(yǎng)基上，進行剛果紅實驗。

（3）剛果紅實驗步驟：待所點菌種在CMC平板上長出可見菌落后，往平板里加入適量1 mg/mL的剛果紅溶液，染色1 h后，棄去染色液，并同時用蒸餾水清洗，最后加入適量1 mol/L的NaCl溶液，脫色1 h，觀察水解圈直徑與菌落直徑的大小。

（4）復(fù)篩：將初篩的菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，測得粗酶液的濾紙酶活和CMC酶活，最終以酶活值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出纖維素酶高產(chǎn)菌株。

（5）霉菌孢子的獲得：將選育出的纖維素酶高產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)接到察氏培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5～6 d，待平板上長出大量孢子后，用無菌水將孢子洗下，并用無菌脫脂棉過濾除去菌絲，將孢子懸浮液過濾到加有玻璃珠的三角瓶中，搖床振蕩30 min，保證90%以上的孢子為單孢子，顯微鏡下觀察，血球板計數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度至106個/mL。

（6）甲基磺酸乙酯（EMS）誘變：吸取1 mL已調(diào)節(jié)好濃度的孢子懸浮液于無菌離心管中，5000 r/min離心5 min收集孢子，用1 mL無菌水同樣條件離心洗滌1次，離心后懸浮孢子于1 mL無菌磷酸緩沖液（pH7.0）中，分別加20 μL、30 μL、40 μL、50 μL和60 μL EMS原液，振蕩分散孢子，分別置于28℃搖床中振蕩90 min，然后5000 r/min立即離心5 min，棄上清液，用5%Na2S2O3離心洗滌2次終止反應(yīng)，再懸浮孢子于1 mL無菌水中，稀釋到10-4，吸取0.2 mL稀釋液涂布于察氏培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3～4 d。

（7）EMS連續(xù)誘變：出發(fā)菌株經(jīng)EMS誘變后，經(jīng)初篩、復(fù)篩后選育出1株產(chǎn)酶活高的誘變菌株，然后再次以該誘變菌株為出發(fā)菌株，進行下一輪的EMS誘變，按同樣的方法進行初篩、復(fù)篩。

（8）突變菌株傳代實驗：將選育得到的高產(chǎn)纖維素酶突變菌株依次傳代5代培養(yǎng)，按上述方法依次測定每代菌株的酶活，考察傳代次數(shù)對誘變菌株產(chǎn)酶性能的影響。

（9）種曲培養(yǎng)：培養(yǎng)基配方為谷草粉60%，麩皮40%，加2.5倍水拌勻后，0.1 MPa蒸汽滅菌30 min，冷卻后接種斜面保藏的高產(chǎn)纖維素酶菌種，于32℃條件下培養(yǎng)5 d。

（10）功能性簾子曲培養(yǎng)制備：培養(yǎng)基配方為谷草粉70%，麩皮30%，加2倍的營養(yǎng)鹽溶液。營養(yǎng)鹽溶液組分為：NaNO31.5%，（NH4）2SO40.8%，（NH4）2HPO40.2%，MgSO40.05%，經(jīng)常壓蒸汽蒸煮1 h后，含水量為70%，物料冷卻后接入按（9）方法培養(yǎng)的種曲2%，拌勻后置于竹簾上，料層厚度為2.5 cm，于30～32℃下培養(yǎng)3～4 d即可。

1.2.2高產(chǎn)纖維素酶菌株在丟糟中的應(yīng)用

1.2.2.1本部分采用以下工藝

新鮮丟糟→攤晾→噴灑糖化酶液→拌勻、攤晾→撒功能性纖維素簾子曲粉→拌勻、攤晾→噴灑TH-AADY活化液→拌勻→入窖發(fā)酵→出窖→蒸酒

1.2.2.2工藝要點

（1）糖化酶液的制備。將糖化酶按照1∶10的比例加入30℃的溫水溶解即可，需現(xiàn)用現(xiàn)配，以免時間太長失活。

（2）TH-AADY活化液。將TH-AADY用滅菌后的2%的葡萄糖溶液溶解，置于30～32℃保溫室中活化2 h備用。

（3）入窖發(fā)酵。將蒸酒結(jié)束后的丟糟攤晾至57～62℃，均勻噴灑糖化酶液，用量依照200～300 U/g淀粉添加，拌勻攤晾至47～52℃，撒入功能性纖維素酶簾子曲粉，用量為1.0～2.0 kg/100 kg丟糟，繼續(xù)拌勻攤晾至28～31℃時，撒入TH-AADY活化液，TH-AADY使用量為1‰～2‰，拌勻后入窖發(fā)酵。

（4）發(fā)酵與蒸酒。發(fā)酵至15 d后，即可出窖蒸酒。蒸酒要按照“掐頭去尾”原則，蒸酒過程中控制好流酒溫度及流酒速度。

1.3分析、測定方法

纖維素酶活測定法：包括CMC酶活及濾紙酶活，采用DNS法；菌落數(shù)測定法：平皿培養(yǎng)法；酒精度測定：比重法；總酸總酯測定：滴定法；淀粉測定法：DNS法；糟酒主要成分測定法：氣相色譜法。

2　結(jié)果與分析

2.1高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育

2.1.1大曲中初篩結(jié)果

經(jīng)過多次篩選工作，本實驗從30份大曲樣品中共挑取106株菌，將其進行分離純化后，通過剛果紅實驗分別觀察其水解圈的大小及清晰程度，最后從106株菌中篩選出36株（編號為1#—36#）進行下一步的復(fù)篩工作。部分初篩菌落見圖1，產(chǎn)纖維素酶菌株在剛果紅平板上所形成的水解圈見圖2。

圖1　部分初篩菌落

圖2　產(chǎn)酶菌株在剛果紅平板上的水解圈

2.1.2復(fù)篩結(jié)果

將通過剛果紅平板初篩出的36株菌發(fā)酵后測定濾紙酶活以及CMC酶活大小，其結(jié)果見表1。

表1　產(chǎn)纖維素酶菌株酶活

通過初篩與復(fù)篩，獲得了1株產(chǎn)纖維素酶能力較高的菌株，編號為18#，將此菌株通過進一步誘變以提高其產(chǎn)酶能力。

2.1.3EMS濃度對菌株致死率的影響

根據(jù)1.2.1.2中（6）實驗方法分別用濃度為20 μL/mL、30 μL/mL、40 μL/mL、50 μL/mL和60 μL/mL的EMS原液，處理18#孢子懸浮液90 min，經(jīng)稀釋適當(dāng)濃度后涂布在察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)計數(shù)，所得致死率結(jié)果見圖3。

圖3　EMS處理濃度對孢子致死率的影響

由于誘變菌株有正突變株和負(fù)突變株，一般認(rèn)為致死率在70%～80%的平皿獲得正突變菌株的機率最高。由圖3可知，EMS處理濃度為40 μL/mL時的致死率在此范圍內(nèi)，因此確定EMS誘變該菌株的最佳條件為：在pH7.0磷酸緩沖液條件下，EMS濃度40 μL/mL，處理時間90 min。

2.1.4出發(fā)菌株與誘變菌株剛果紅平板圖（圖4）

圖4　出發(fā)菌株與誘變菌株的剛果紅平板實驗圖

2.1.5第一輪初篩結(jié)果

18#按1.2.1.2中（6）實驗方法經(jīng)EMS誘變后從初篩平板上共挑出70株菌，依次將其點接到CMC平板上，分別測定其“水解圈直徑/菌落直徑”比值。通過剛果紅實驗，共獲得8株菌，其“水解圈直徑/菌落直徑”比值比出發(fā)菌株提高25%。

2.1.6第一輪復(fù)篩結(jié)果

將2.1.5初篩出的8株菌進行發(fā)酵產(chǎn)酶測酶活，其結(jié)果見表2。

表2　第一輪復(fù)篩結(jié)果

18#經(jīng)誘變后，經(jīng)剛果紅平板篩出的8株菌經(jīng)發(fā)酵后測定酶活，濾紙酶活提高幅度最大的是Y39，提高幅度為58.5%；CMC酶活提高幅度最大的是Y52，提高幅度為42.1%，但綜合考慮濾紙酶活與CMC酶活，選取Y31作為下一輪誘變的出發(fā)菌株。

2.1.7第二輪初篩結(jié)果

Y31按1.2.1.2中（6）實驗方法經(jīng)EMS再次誘變后，從初篩平板上共挑取87株誘變菌株，依次進行剛果紅平板實驗，根據(jù)水解圈大小情況，共選出10株進行下一步的發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩。

2.1.8第二輪復(fù)篩結(jié)果

將2.1.7初篩出的10株菌進行發(fā)酵產(chǎn)酶測酶活，其結(jié)果見表3。

表3　第二輪復(fù)篩結(jié)果

Y31經(jīng)EMS再次誘變后，通過初篩挑出的10株菌中，濾紙酶活提高幅度最大的是RY67，比出發(fā)菌株提高了35.6%；CMC酶活提高幅度最大的是RY25，比出發(fā)菌株提高了41.6%，綜合考慮濾紙酶活與CMC酶活，誘變效果最好的為RY49，其濾紙酶活和CMC酶活分別比出發(fā)菌株提高了24.8%、35.9%。將RY49作為本實驗最終選育的高產(chǎn)纖維素酶的誘變菌株，進行下一步研究利用。

2.1.9誘變菌株傳代實驗

誘變菌株必須具有較為穩(wěn)定的遺傳穩(wěn)定性，才具有實際應(yīng)用價值。為了測定傳代次數(shù)對誘變菌株RY49產(chǎn)纖維素酶性能的影響，將該誘變菌株在察氏平板上傳代培養(yǎng)。由圖5可以看出，當(dāng)傳代次數(shù)在5次之內(nèi)時，酶活的變化較小，隨著傳代次數(shù)的增加，酶活略有下降，說明傳代次數(shù)對該誘變菌株產(chǎn)酶性能的影響不大。

圖5　傳代次數(shù)對誘變菌株酶活的影響

2.2RY49在綿柔型丟糟中的應(yīng)用

2.2.1丟糟入池二次發(fā)酵前后指標(biāo)對比結(jié)果見表4。

表4　入池前后指標(biāo)分析

2.2.2正交實驗結(jié)果

正交實驗是常用的優(yōu)化工藝條件的方法，為了對丟糟產(chǎn)酒工藝條件進行優(yōu)化，設(shè)計了3因素3水平的正交實驗（見表5）。本實驗中選取功能性纖維素酶簾子曲用量、TH-AADY活化液用量以及糖化酶液用量為考察因素，根據(jù)文獻資料和單因素實驗確定各因素的水平數(shù)和各水平的取值，以出酒率為指標(biāo)，采用正交表L9（33）進行正交實驗，實驗結(jié)果見表6。

表5　因素水平表

表6　正交實驗結(jié)果

從表6可以看出，利用丟糟進行二次發(fā)酵產(chǎn)酒時各組分的最佳添加量為：功能性纖維素酶簾子曲用量為1.5 kg/100 kg丟糟，糖化酶用量為250 U/g淀粉，THAADY添加量為1.5‰，此時出酒率為3.89%。

丟糟中殘余淀粉含量為11.3%，進行入池二次發(fā)酵結(jié)束后殘留淀粉降為5.8%，淀粉含量降低了5.5%，淀粉再利用率達到48.7%，丟糟出酒率為3.89%（按60%vol計），進一步證明了利用功能性纖維素酶簾子曲、糖化酶以及TH-AADY進行丟糟再發(fā)酵產(chǎn)酒具有可行性，并能產(chǎn)生較為可觀的經(jīng)濟效益。

2.2.3糟酒主要理化指標(biāo)

糟酒理化指標(biāo)及感官品評結(jié)果見表7和表8。

表7　糟酒理化指標(biāo)

表8　糟酒感官品評結(jié)果

3　結(jié)果與討論

3.1霉菌需要纖維素類物質(zhì)或其衍生物作為誘導(dǎo)物才能分泌纖維素酶，但由于纖維素不溶于水，本課題采用纖維素的衍生物CMC（羧甲基纖維素鈉）作為唯一碳源來篩選高產(chǎn)纖維素酶的霉菌。

3.2在篩選過程中發(fā)現(xiàn)個別菌株在剛果紅培養(yǎng)基平板上水解圈較大，但經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩后，其CMC酶活和FPA酶活并不高，其原因可能是篩選所用的固體培養(yǎng)基和發(fā)酵所用的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件不同；另外，篩選培養(yǎng)基的厚度和菌落菌體量的差異也會影響水解圈的大??；還有菌體在平板上和液體培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)物質(zhì)、排出代謝產(chǎn)物難易程度不同；以及不同菌株具有不同的生長和產(chǎn)酶速度以及不同的纖維素酶系；另外有些菌株水解圈較大，可能是因為它的CMC酶活較高，尤其在羧甲基纖維素鈉初篩培養(yǎng)基平板上這種現(xiàn)象更為明顯一些。總之，通過觀察平板上水解圈的初篩方法可以將一大批產(chǎn)酶能力差的菌株篩選出去，大大提高了篩選效率。

3.3經(jīng)過2次EMS連續(xù)誘變后，得到了1株纖維素酶活較高的誘變菌株RY49，其纖維素酶活達到了濾紙酶活91.32 U/mL，CMC酶活273.56 U/mL，比出發(fā)菌株分別提高了68.1%和53.6%。經(jīng)傳代培養(yǎng)實驗，證明該菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性良好。

3.4考慮到使用過程中的方便性以及確保酶活不易失活等因素，本研究中選育的高產(chǎn)纖維素酶菌株并未直接應(yīng)用，而是進一步制備成功能性纖維素酶簾子曲加以應(yīng)用，但所制的簾子曲屬于粗產(chǎn)品，由于技術(shù)條件有限，未進行進一步純化，因此酶活相對較低，如果進行純化后，可能會進一步提高酒糟產(chǎn)酒率，但綜合考慮提純成本與糟酒的效益，進行提純后可能得不償失。

3.5本實驗僅對丟糟再發(fā)酵產(chǎn)酒進行了初步研究，最佳添加量：功能性纖維素酶簾子曲用量為1.5 kg/100 kg丟糟，糖化酶用量為250 U/g淀粉，TH-AADY添加量為1.5‰，此時出酒率為3.89%。如果還需進一步研究，可對發(fā)酵時間、入窖酸度等因素進行深入的研究。

3.6在丟糟發(fā)酵產(chǎn)酒中還可加入一定量大曲粉，或加入不同種類的功能性細(xì)菌簾子曲、功能性酵母簾子曲，除有效提高丟糟出酒率外，還能提升糟酒的感官質(zhì)量。

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Breeding of a Strain with High Yield of Cellulase from Daqu and Its Application in Waste Distillers Grains of Soft-Flavor Baijiu

YANG Jianmei，WANG Xiaohui，WANG Yongwei and LUO Xia
（Yanghe Distillery Co.Ltd.，Suqian，Jiangsu 223800，China）

A strain with strong cellulase-producing capability was screened from Daqu.After continuous mutagenesis，a mutant strain RY49 with high yield of cellulase was obtained.Strain RY49 was then used for the preparation of functional bran starter.Such starter，coupled with saccharifying enzyme and TH-AADY，were used for secondary fermentation of waste distillers grains of soft-flavor Baijiu，and liquor yield could reach up to 3.89%（60%vol liquor/100 kg waste distillers grains）.As a result，the additional benefits of waste distillers grains got improved efficiently.

high yield of cellulase；strains；mutation；waste distillers grains；functional bran starter；saccharifying enzyme；TH-AADY；Baijiu

TS261.1；Q93-3；TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2016）08-0071-05

10.13746/j.njkj.2016168

2016-05-17

楊建梅（1987-），女，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事微生物的檢測及應(yīng)用相關(guān)研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-05-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160526.1216.012.html。