西藏青稞品種藏青13高氮處理的SSH文庫構建及分析

徐齊君，王玉林，原紅軍，曾興權，尼瑪扎西*

（1.西藏自治區(qū)農牧科學院農業(yè)研究所，西藏拉薩850002；2.省部共建青稞種質改良和牦牛繁育國家重點實驗室，西藏拉薩850002）

·綜述報告·

西藏青稞品種藏青13高氮處理的SSH文庫構建及分析

徐齊君1，2，王玉林1，2，原紅軍1，2，曾興權1，2，尼瑪扎西1，2*

（1.西藏自治區(qū)農牧科學院農業(yè)研究所，西藏拉薩850002；2.省部共建青稞種質改良和牦牛繁育國家重點實驗室，西藏拉薩850002）

為了分析青稞高氮處理相關基因的表達，以藏青13為實驗材料，通過抑制差減雜交構建了青稞高氮處理下的差減cDNA文庫。在隨機挑取的281個陽性克隆中，測序獲得219條高質量的EST，含有212條非重復且與Genbank中的基因或蛋白具有較高的同源性的序列。對其進行Blast2Go功能注釋可將差異表達的基因定位到細胞組件、分子功能和代謝過程3大類內。通過KEGG代謝途徑分析，212個比對結果中的117個ESTs有詳細的KO功能注釋，定位到17個具體的代謝途徑上，且主要定位在光合作用碳固定途徑和氮素代謝途徑。此外，分析還發(fā)現(xiàn)這些基因主要是編碼參與結構和功能代謝合成途徑中的一些酶，且參與信號轉導、轉錄調節(jié)和光合作用等生理過程，說明這些基因很可能參與到青稞在高氮處理下的抗性反應中。關鍵詞：青稞；高氮處理；SSH；EST

網絡出版時間：2016-03-18

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/32.1769.S.20160318.2016.001.html

西藏地區(qū)普遍存在著土壤貧瘠、施肥少等嚴重問題，從而導致農業(yè)生產水平低下［1］。青稞（Hordeum vulagare L.）是禾本科小麥族大麥變種之一，主要分布于西藏、青海、甘肅省甘南等藏族自治區(qū)，是一種非常重要的高原谷類作物，具有早熟、耐寒、穩(wěn)產和適應性廣等特點，是青藏高原地區(qū)的主要糧食作物［2］。2009—2011年，藏青13在拉薩市曲水縣南木鄉(xiāng)南木村展示種植2.5hm2，平均產量為405.21kg/667m2，較對照藏青320的3 19.59 kg/ 667m2增產2 6.77%。該品種種植范圍相對較小，需肥量大，不耐貧瘠，但產量較高［3-4］。氮是作物生長和發(fā)育的重要因子，是構成植物體各種生物大分子的重要組成部分，氮能提高葉綠素和蛋白質的含量從而影響植物體內的其他代謝活動［5］，因此植物的生長發(fā)育離不開氮素的供給［6］。氮肥的施用可改善土壤貧瘠狀況，提高青稞光合作用效率，增強其抗逆性，從而使青稞增產30%～50%［7］。

SSH（Suppression subtractive hybridization，抑制差減雜交）技術被廣泛應用于分離植物特異表達和誘導表達的基因［8-11］。本研究利用青稞藏青13不耐貧瘠、需肥量大、產量高等特點，采用SSH技術構建青稞在適氮和高氮處理的差減cDNA文庫，探討青稞在高氮處理下相關基因的表達情況，為系統(tǒng)研究青稞抗性分子機理奠定基礎。

1　材料和方法

1.1材料

以青稞藏青13為實驗材料，經3.5%NaClO溶液消毒15min后，用蒸餾水沖洗干凈，置于光照培養(yǎng)箱（25℃，黑暗）中催芽3 d，再用蒸餾水培養(yǎng)1d，之后用Hoagland營養(yǎng)液（N濃度為4mmol/L）培養(yǎng)14d，每2d更換一次營養(yǎng)液，并保持吹氧通氣，然后用含N濃度為40mmol/L的Hoagland營養(yǎng)液進行高氮脅迫處理，以Hoagland營養(yǎng)液（N濃度為4mmol/L）進行適氮處理的為對照，處理2d后采取藏青13的葉片，置于液氮中速凍，保存于-70℃冰箱。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取和mRNA的純化。分別提取經高氮處理和適氮處理的藏青13葉片的總RNA，提取方法參照Trizol（TaKaRa）的操作方法，用紫外分光光度計檢測其質量和濃度，然后參照Oligotex（Qiagen）的操作方法分離和純化mRNA。

1.2.2抑制差減雜交及PCR產物的克隆。根據(jù)SMART PCR cDNA Synthesis Kit（Clontech）操作方法，將mRNA合成cDNA，隨后對得到的cDNA進行純化并在RsaI酶切下產生比較短的平端片段，便于下一步的接頭連接和兩次的差減雜交，具體操作參考PCR-Select cDNA Subtraction Kit（Clontech）說明書，分別以高氮處理的作為 driver、適氮處理的作為tester和以適氮處理的作為driver、高氮處理的作為tester進行兩次差減雜交，將兩種差減雜交的第2 次PCR產物純化后與pMD18-T（Takara）連接，構建兩個抑制差減cDNA文庫。將連接產物轉化感受態(tài)細胞DH5α，涂布于含X-gal/IPTG和Amp的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取白色克隆［1-2］。

1.2.3差減文庫cDNA片段大小檢測、測序及序列分析。將隨機挑取200個白色克隆，在 37℃下培養(yǎng)5h以上，取1 μL菌液作模板，用Nested primer 1和Nested primer2R為引物進行PCR檢測，鑒定差減雜交cDNA片段。PCR反應條件如下：94℃，5min；然后9 4℃，10sec；68℃，30sec；72℃，1.5min，擴增30個循環(huán)。將陽性克隆進行測序。

將測序得到的DNA片段利用美國生物信息中心網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的核酸數(shù)據(jù)庫Blastn和蛋白數(shù)據(jù)庫Blastx進行同源核苷酸和蛋白序列分析。最后，通過Blast2Go軟件對所獲得的ESTs序列進行Go功能注釋。所有的ESTs序列用KEGG軟件進行代謝途徑分析，將基因定位到具體的代謝途徑中，找出與高氮脅迫下密切相關的代謝途徑［13］。

2　結果與分析

2.1總RNA和mRNA的質量檢測

高氮處理和適氮處理的藏青13樣品總RNA用 Trizol提取后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶顯示大部分RNA集中在18S和28S rRNA區(qū)域間（圖1），說明提取的樣品總RNA完整性較好。經紫外分光光度計檢測其OD260/OD280的比值均在1.85～2.10之間，說明總RNA純度較高，可進一步用于提取mRNA。純化后的mRNA呈現(xiàn)彌散狀的亮帶，說明mRNA質量良好，可用于下一步的cDNA合成。

圖1　藏青13樣品總　RNA電泳圖譜HN：高氮處理樣品；ON：適氮處理樣品

2.2雙鏈cDNA的合成及RsaⅠ酶切消化

將純化后的mRNA按照SMART cDNA文庫合成的方法合成雙鏈cDNA。取5μL雙鏈cDNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，片段主要分布于200～5000 bp之間（圖2）。然后用RsaI酶切3 h，產物主要集中在200～800 bp間（圖3），長片段得到有效的消化，說明酶切效果好，適于后續(xù)實驗。

2.3差減文庫的構建及鑒定

將進行兩次差減雜交得到的差異片段進行第2次PCR擴增后的產物與pMD18-T連接，構建兩個抑制差減cDNA文庫。從每個差減cDNA文庫隨機挑取200個克隆，用Nested primer 1和Nested primer2R為引物進行PCR鑒定后，分別篩選到145和136個有效陽性克隆，插入片段長度主要分布于150～750 bp之間（圖4）。這些陽性克隆將有利于今后分離、鑒定與之相關的基因。

圖2　雙鏈　cDNA合成產物電泳圖M：DNA分子量標準；HN：高氮處理；ON：適氮處理

圖3　酶切質量檢測M：DNA分子量標準；HN：高氮處理；ON：適氮處理

圖4　PCR檢測　cDNA差減文庫克隆插入片段M：DNA分子量標準；1-16：隨機挑選的克隆

2.4ESTs序列分析

將上述281個克隆，去除載體與接頭序列后，與NCBI-GenBank比對后，共獲得2 12條比對結果。將功能注釋的結果進行物種統(tǒng)計（圖5）。從圖5可以看出，青稞和蒺藜苜蓿、大麥、水稻、耐酸草、節(jié)節(jié)麥、玉米、小麥等單子葉禾本科植物具有較高的同源性。

對文庫進行Blast2Go功能分類注釋，可將差異表達的基因定位到細胞組件、分子功能和代謝過程3大類內（圖6）。根據(jù)生物學進程的劃分，我們發(fā)現(xiàn)在文庫中所占比重最高的前兩組為代謝過程和細胞過程。根據(jù)分子功能進行劃分，所有差異基因被劃分為7種功能類群，所占比重最高的前兩組分別為結合功能類和催化劑功能類，而根據(jù)細胞組成進行劃分，在文庫中比例最高的兩組分別是細胞和細胞器。

圖5　青稞注釋數(shù)據(jù)和其他物種的相似度

圖6　青稞高氮處理差減文庫的　GO分析

通過KEGG分析，212個比對結果中有117個ESTs有詳細的KO功能注釋，定位到17個具體的代謝途徑上（表1）。其中定位到光合作用碳固定途徑（Carbon fixation in photosynthetic organisms）65個，氮素代謝（Nitrogenmetabolism）17個，核蛋白體（Ribosome）13個，光合作用途徑（Photosynthesis）13個，氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）8個，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝途徑（Alanine，aspartate and glutamatemetabolism）2個，植物激素信號傳導（Plant hormone signal transduction）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrosemetabolism）等的ESTs均為1個。

在這些詳細功能注釋的ESTs序列中（表2），又可分為5大類，其中：75條EST參與到結構和功能代謝合成途徑中，占64.1%；24條EST參與到信號轉導和轉錄調節(jié)中，占20.5%；13條 EST參與光合作用；4條EST參與到編碼保護、防御和脅迫耐受中；1條EST參與跨膜轉運中。

表1　KEGG軟件分析的部分高氮處理誘導代謝途徑分析

表2　青稞幼苗葉片高氮處理下部分差異表達的基因

3　討論

在農作物生理與分子機理研究中，抗熱、抗低溫、耐鹽堿、抗貧瘠等抗性機理一直都是首要研究任務［14-17］。對青稞生長環(huán)境而言，地處高原、土地貧瘠等現(xiàn)實困境給青稞優(yōu)良品種培育造成了極大的困擾［18］。因此通過SSH技術，可以發(fā)掘在高氮處理下誘導表達的基因，為下一步克隆關鍵基因，進行基因功能研究，分析青稞抗性分子機理奠定基礎。

本研究共獲得281個克隆，通過分析青稞在高氮處理下誘導表達的基因，發(fā)現(xiàn)主要涉及以下3類：第一類是參與結構和功能代謝合成途徑中的一些酶及光合作用相關的基因，如葉綠體核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（Ribulose-bisphosphate carboxylase）、光系統(tǒng)II蛋白D1（Photosystem II protein D1）、H+轉運ATP合酶（H+-transporting ATPase）等；第二類是參與信號轉導和轉錄調節(jié)的基因，如核糖體蛋白S12和S7（Ribosomal protein S12和S7）、酪蛋白激酶（Casein kinase II）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase）、絲/蘇氨酸蛋白激酶（Serine/Threonine-protein kinase）等；第三類是編碼保護、防御和脅迫耐受蛋白的基因，主要是防御和降低高氮處理造成的傷害，如ABA響應結合因子（ABA responsive element binding factor）等。而通過NCBI比對和Blast2Go功能分類注釋，根據(jù)細胞組成分析，發(fā)現(xiàn)差異基因在細胞和細胞器中比例最高，根據(jù)分子功能進行劃分，所占比重最高的前兩組分別為結合功能類和催化劑功能類。通過KEGG代謝途徑分析，定位到17個具體的代謝途徑，其中主要定位在光合作用碳固定途徑（Carbon fixation in photosynthetic organisms）和氮素代謝（Nitrogenmetabolism）途徑。

氮是植物生長和發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素，也是限制植物生長和產量形成的首要因素［19］。氮是核酸、蛋白質、酶和葉綠素等重要物質的組成成分。葉片中氮含量變化影響光合效率和光合產物的形成［20］。在高氮處理下，植物體內葉綠體核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶含量增加，從而增加光合作用中CO2的固定，當?shù)^量時，氮的代謝過程也會相應的增強，氮代謝包括各種蛋白質代謝，如天門冬氨酸、谷氨酸代謝途徑等氨基酸代謝途徑［21］。在植物整個生長期供應過多的氮，會造成生育期延長，使作物貪青晚熟。在高氮條件下，植物本身為消化這些物質會消耗掉過多的糖類物質，從而導致品質降低，產量減少。

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Construction and Analysis of the SSH Libraries of the Tibetan Hulless BarleyVariety Zangqin 13 Treated with High Nitrogen

XU Qi-jun1，2，WANG Yu-lin1，2，YUAN Hong-jun1，2，ZENG Xing-quan1，2，NIMA Zha-Xi1，2
（1.Research Institute of Agriculture，Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Lhasa 850002，China；2.Barley Improvement and Yak Breeding Key Laboratory of Tibet Autonomous Region，Lhasa 850002，China）

To analyze the genes responsive to high-nitrogen treatment in Tibetan hulless barley，suppression subtractive hybridization（SSH）was utilized to construct the differential expression cDNA libraries using the hulless barley variety Zangqin 13.From the two constructed cDNA libraries，281positive clones were randomly selected and subjected to sequencing；consequently，219 qualified ESTs containing212 unigenes were obtained.The similarity analysis of expressed sequence tags（ESTs）of these unigenes was performed with Blastx and Blastn against the non-redundance database in GenBank.The results showed that the212 sequences were homologous with some genes or proteins in GenBank，which are responsible for biological process，cellular components，andmolecular functions according to the analysis of Blast2Go.In the analysis of KEGG，117 ESTs of the212 sequences weremapped to 17metabolic pathways.Specifically，these unigenes encode enzymes that are involved in the structure and function of somemetabolic synthesis pathways；as well as in signal transduction，transcriptional regulation，and photosynthesis.This suggests that these genesmay contribute to the tolerance of Tibetan hulless barley to high nitrogen treatment.

Tibetan hulless barley；High nitrogen treatment；Suppression subtractive hybridization（SSH）；Expressed sequence tags（ESTs）

S512.3

A

1673-6486-20150129

2015-12-18

國家科技支撐計劃（2012BAD03B01）；西藏財政專項（2015CZZX001）。

徐齊君（1984—），女，碩士，助理研究員，主要從事青稞遺傳育種研究。E-mail：xuqijun_1314@163.com。

尼瑪扎西（1966—），男，博士，研究員，主要從事青稞遺傳育種研究。E-mail：nima_zhaxi@sina.com。