秀麗隱桿線蟲-泛耐藥肺炎克雷伯菌感染模型的建立

王　訊，孫樹梅，歐陽妮，張亞莉，芮勇宇

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣東 廣州　510515)

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·論著·

秀麗隱桿線蟲-泛耐藥肺炎克雷伯菌感染模型的建立

王訊，孫樹梅，歐陽妮，張亞莉，芮勇宇

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣東 廣州510515)

目的建立泛耐藥肺炎克雷伯菌(XDRKP)感染秀麗隱桿線蟲感染模型。方法在液體條件下，利用臨床分離的XDRKP菌株感染秀麗隱桿線蟲，觀察線蟲存活及體內細菌數(shù)量變化情況。結果線蟲感染XDRKP后活動明顯遲緩，不同濃度的XDRKP對線蟲的致死情況不同。log-rank檢驗顯示，1.5×106CFU/mL XDRKP組與E.coliOP50對照組的生存曲線差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.08，P>0.05)；1.5×107、1.5×108CFU/mL組與E.coliOP50對照組的生存曲線差異均有統(tǒng)計學(χ2值分別為229.37、275.98，均P<0.001)，1.5×108與1.5×107CFU/mL XDRKP組線蟲的生存率低于對照組。實驗獲得上清懸液，經細菌純培養(yǎng)后進行細菌鑒定和藥敏測試，證實為XDRKP。XDRKP感染線蟲4、6、12、24 h后，線蟲體內細菌總量分別為(0.28±0.02)×105、(0.50±0.38)×105、(1.73±0.56)×105、(2.62±0.53)×105CFU/mL，不同時間線蟲體內細菌總數(shù)存在統(tǒng)計學差異(F=1 363.39，P<0.001)。結論成功建立了秀麗隱桿線蟲-XDRKP感染模型。

秀麗隱桿線蟲； 泛耐藥； 肺炎克雷伯菌； 感染； 模型

[Chin J Infect Control，2016，15(7)：457-460]

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)屬腸桿菌科細菌，是引起醫(yī)院感染的常見條件致病菌。近年來，隨著碳青霉烯類抗生素的長期、大量、廣泛使用，導致耐碳青霉烯類腸桿菌科(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)菌株的檢出率呈上升趨勢。2014年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測結果發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)腸桿菌科細菌中均存在CRE菌株，以克雷伯菌屬最多，該菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均>10%[1]。由于CRE菌株往往呈泛耐藥(extensively drug resistance，XDR)或全耐藥(pandrug resistance，PDR)的特征，導致感染患者可能陷入無藥可用的困境[2]。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)是一種國際公認、簡單有效的模式生物，其具有結構簡單、遺傳背景清晰、生命周期短等特點，在病原菌研究中的應用越來越廣泛。目前，已證實約40種人類致病菌(包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌)會對線蟲造成感染[3]，其致病機制與其在哺乳動物中的表現(xiàn)極相似。鑒于國內外關于KP感染秀麗隱桿線蟲少有報道，本研究利用臨床上分離的泛耐藥肺炎克雷伯菌(extensively drug-resistantKlebsiellapneumoniae，XDRKP)，建立秀麗隱桿線蟲-泛耐藥肺炎克雷伯菌感染模型，為研究病原菌致病機制及抗感染藥物篩選奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1線蟲和細菌野生型秀麗隱桿線蟲(WT Bristol N2)、大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)OP50由中山大學實驗室惠贈；臨床分離的XDRKP由廣州市南方醫(yī)院臨床微生物室提供，采用美國BD公司生產的Phoenix-100型全自動細菌鑒定和藥敏測試系統(tǒng),依據(jù)2015年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)M100-S25藥敏試驗標準判定[4]。

1.1.2培養(yǎng)基NGM(nematode growth media)培養(yǎng)基：胰蛋白胨25 g，瓊脂粉17 g，NaCl 3 g，加入蒸餾水975 mL，高溫高壓滅菌后冷卻至55℃，分別加入無菌膽固醇溶液(5 mg/mL，無水乙醇)1 mL，PBS液(pH=6.0)25 mL，1 mol/L MgSO41 mL，1 mol/L CaCl21mL，1 mol/L制霉菌素1 mL，分裝至直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，備用；LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制。

1.1.3緩沖液及試劑M9緩沖液：6 g Na2HPO4，3 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO4·7H2O，加入蒸餾水1 L，高壓滅菌后備用；線蟲裂解液：4 mL蒸餾水，2 mL次氯酸鈉溶液，0.45 g NaOH，現(xiàn)用現(xiàn)配；疊氮化鈉(NaN3)、5-氟-2-脫氧尿嘧啶(FUDR)均購置于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1線蟲的培養(yǎng)線蟲按照國際標準程序[5]進行培養(yǎng)。

1.2.2線蟲同期化處理用M9緩沖液從NGM培養(yǎng)板上洗下蟲體，收集、離心(3 500 r/min，3 min)、棄上清，剩余3.5 mL，加入1.5 mL線蟲裂解液，劇烈震蕩約8 min，M9洗滌3次，即從妊娠的成體線蟲中分離得到蟲卵，后20℃振蕩過夜孵育，獲得L1期幼蟲，將其置于新的NGM平板E.coliOP50菌苔上，20℃培養(yǎng)48 h，即得到同步化的L4期線蟲。

1.2.3菌懸液的配制將凍存的菌株復蘇，劃線培養(yǎng)，挑取單個菌落，再接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min 震蕩培養(yǎng)一定時間，備用。

1.2.4線蟲感染致死實驗用M9緩沖液從平板上洗下培養(yǎng)至L4期線蟲，離心(3 500 r/min，3 min)，重復2～3次，懸浮后取10 μL在顯微鏡下觀察線蟲懸液中線蟲的數(shù)量，然后取含有20～30條線蟲的懸液置于96孔板中，感染組分別加入終濃度為1.5×108、1.5×107、1.5×106CFU/mL的XDRKP，陰性對照組加入終濃度為 1×109CFU/mL的E.coliOP50，空白對照組加入20%LB溶液；每種菌液做5個平行，其中為防止N2線蟲繁殖，滴加0.2 mmol/L的FUDR，96孔板放置于相對濕度80%～85%的培養(yǎng)箱，20℃培養(yǎng)，每天記錄線蟲的存活數(shù)。所有組均重復3次。

1.2.5線蟲腸道內細菌計數(shù)選取1.5×108CFU/mL XDRKP感染線蟲，每隔一定的時間，挑取10條經細菌感染的線蟲，用含有l(wèi) mmol/L NaN3(麻醉劑)的M9緩沖液清洗3遍，以清除線蟲體表的細菌，然后轉移至裝有400 mg石英砂的小試管，加1 mL PBS緩沖液渦旋振蕩2～3 min，得到的上清懸浮液稀釋涂布、計數(shù)，以確定每條線蟲體內細菌數(shù)量。

1.2.6感染線蟲腸道細菌鑒定經上述1.2.5步驟得到的上清懸液，經細菌純培養(yǎng)后，進行細菌重新鑒定及藥敏測試[4]。

1.3統(tǒng)計分析應用SPSS 20.0軟件，線蟲生存時間采用Kaplan-Meier方法進行生存分析，log-rank檢驗法對組間的數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。計量資料采用完全隨機設計方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1XDRKP對線蟲的感染致死判定XDRKP感染秀麗隱桿線蟲，顯微鏡下觀察，活蟲呈正弦曲線特征，咽部肌肉運動；而XDRKP感染的死亡線蟲呈直線型，咽部無運動，見圖1。

虛線箭頭：線蟲處于存活狀態(tài)；實線箭頭：線蟲處于死亡狀態(tài)

Figure 1Death / survival status ofC.elegansinfected with XDRKP

2.2秀麗隱桿線蟲生存時間比較采用不同濃度XDRKP感染秀麗隱桿線蟲，以線蟲是否死亡為結局變量，記錄線蟲的生存狀況以及作生存分析。結果顯示，其中7 d觀察線蟲生存狀況，不同細菌濃度(1.5×108、1.5×107、1.5×106CFU/mL XDRKP，以及E.coliOP50對照組)的線蟲平均存活率分別為0、25.31%、83.95%、100%。隨著細菌濃度降低，線蟲的最長存活時間與線蟲半數(shù)致死時間(lethal time of 50%，LT50)有所延長。見表1。采用log-rank檢驗顯示，1.5×106CFU/mL XDRKP組與E.coliOP50對照組的生存曲線無統(tǒng)計學差異(χ2=0.08，P>0.05)；1.5×107、1.5×108CFU/mL組與E.coliOP50對照組的生存曲線差異均有統(tǒng)計學(χ2值分別為229.37、275.98，均P<0.001)，1.5×108與1.5×107CFU/mL XDRKP組的生存率低于對照組。

2.3線蟲腸道內細菌鑒定及計數(shù)選取1.5×108CFU/mL XDRKP感染線蟲，觀察不同時間線蟲存活數(shù)量和狀態(tài)。實驗得到的上清懸液，經細菌純培養(yǎng)后，進行細菌鑒定和藥敏測試，證實為XDRKP。感染XDRKP 4、6、12、24 h后，線蟲體內細菌總量分別為(0.28±0.02)×105、(0.50±0.38)×105、(1.73±0.56)×105、(2.62±0.53)×105CFU/mL。經方差分析，不同時間線蟲體內細菌總數(shù)存在統(tǒng)計學差異(F=1 363.39，P<0.001)；經SNK檢驗顯示，各時間點間體內細菌總量均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明在實驗時間范圍內，隨時間延長，XDRKP感染線蟲體內細菌總量逐漸增加。

表1不同濃度XDRKP感染的秀麗隱桿線蟲生存時間

Table 1Survival time ofC.elegansinfected with different concentrations of XDRKP

細菌種類細菌濃度(CFU/mL)線蟲最長存活時間(d)LT50(d)空白對照01812.00±0.70E.coliOP501092112.00±0.42XDRKP1.5×1061812.00±0.79XDRKP1.5×107106.00±0.20XDRKP1.5×10873.00±0.17

圖2 　不同濃度XDRKP感染的秀麗隱桿線蟲生存曲線

Figure 2Survival curves ofC.elegansinfected with different concentrations of XDRKP

3　討論

秀麗隱桿線蟲是一種以細菌為食的小型土壤線蟲，因其全身透明易于觀察、生命周期短、操作方便簡單、培養(yǎng)成本低廉、可操控性強等優(yōu)點，成為應用廣泛的模式生物。但是，唯有病原菌對線蟲致病，線蟲才有可能作為研究病原菌致病性及抗感染藥物篩選的模型。研究表明，糞腸球菌可以在線蟲腸內繁殖為更高的滴度，導致持續(xù)的感染，不能被根除，但高滴度的屎腸球菌也可以在線蟲的腸內累積，但不會影響線蟲的壽命[6]；國內也有報道，單核細胞增生李斯特菌不能殺死秀麗隱桿線蟲，對線蟲無顯著致病性，不適合作為研究李斯特菌致病機制的模型[7]。本研究利用臨床分離的XDRKP菌株，在液體條件下感染線蟲，通過觀察線蟲的生存狀態(tài)及線蟲腸道細菌數(shù)量變化情況，探討線蟲是否可以作為KP感染的模型。

目前，國內線蟲感染模型多采用經典的固體平板殺線蟲方法[8]，其過程繁瑣。研究[9]報道，固體平板實驗與液體實驗結果相似。本研究采用液體條件下XDRKP菌株感染線蟲，不足之處是未與傳統(tǒng)的固體平板殺線蟲方法作對照。感染菌不是線蟲常規(guī)的食物，研究[10]表明，線蟲能區(qū)分不同細菌的氣味，從而避開對其有害的食物而拒食。避免線蟲為避開感染菌苔而聚集于空白區(qū)域而達不到感染目的，固體實驗感染菌的菌苔涂布采用全板涂布，但是需排除被平皿壁阻擋而死亡的線蟲。

一個優(yōu)秀篩選模型的建立，必須具備良好的可操作性、重復性和穩(wěn)定性，感染病原菌濃度的選擇十分重要，是決定線蟲感染程度的重要條件之一。本實驗根據(jù)病原菌自身生長特點，收集對數(shù)生長末期的菌液感染線蟲被XDRKP感染的線蟲活動明顯遲緩，效果明顯。感染線蟲的XDRKP濃度為1.5×107與1.5×108CFU/mL時，線蟲的存活率低于對照組，線蟲的最長生存時間為7、10 d；XDRKP濃度為1.5×106CFU/mL時，線蟲的存活率與對照組一致，說明在1.5×107、1.5×108CFU/mL濃度范圍內XDRKP對線蟲有感染致死效果，初步建立泛耐藥肺炎克雷伯菌感染秀麗隱桿線蟲感染模型。

本研究證實了線蟲的死亡與腸道內XDRKP感染有關。實驗中，線蟲腸道細菌計數(shù)得到的上清懸液，經細菌純培養(yǎng)，采用全自動細菌鑒定及藥敏結果證實為XDRKP，說明XDRKP進入到線蟲體內，感染了秀麗隱桿線蟲。隨著感染時間的延長，線蟲腸道體內細菌數(shù)不斷定植和繁殖，造成線蟲的永久性感染直至死亡。

綜上所述，本研究利用臨床分離的XDRKP，在液體條件下成功建立了XDRKP感染線蟲的模型，并證實了XDRKP在線蟲體內定植，不斷繁殖導致其死亡，該研究為下一步研究其致病機理以及藥物篩選奠定了基礎。

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(本文編輯：左雙燕)

Establishment of an infection model usingCaenorhabditiselegans-extensively drug-resistantKlebsiellapneumoniae

WANGXun,SUNShu-mei,OUYANGNi,ZHANGYa-li,RUIYong-yu

(NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515，China)

ObjectiveTo establish an infection model usingCaenorhabditiselegans(C.elegans)-extensively drug-resistantKlebsiellapneumoniae(XDRKP)system.MethodsClinically isolated XDRKP strains were used to infectC.elegansin the liquid killing assay, the nematode survival and the number of bacteria inC.elegansdigestive tract was observed.ResultsC.eleganswas significantly retarded after being infected by XDRKP, different concentrations of XDRKP led to different patterns of the worm death. Log-rank test showed that survival curves ofC.elegansinfected with 1.5×106CFU/mL of XDRKP andE.coliOP50(control) were not significantly different (χ2=0.08，P>0.05); survival curves ofC.elegansinfected with 1.5×107CFU/mL, 1.5×108CFU/mL of XDRKP andE.coliOP50were significantly different(χ2=229.37, 275.98，respectively, bothP<0.001). The survival rates of 1.5×108and 1.5×107CFU/mL XDRKP groups were both lower than that of the control group. Supernatant suspension obtained from test was performed bacterial culture, identification and antimicrobial susceptibility testing, XDRKP was determined. After being infected with XDRKP 4, 6, 12, and 24 hours, the total number of bacteria inC.eleganswere(0.28±0.02)×105CFU/mL,(0.50±0.38)×105CFU/mL,(1.73±0.56)×105CFU/mL, and (2.62±0.53)×105CFU/mL，respectively, the number of bacteria inC.elegansdigestive tract was significantly different at different time points (F=1 363.39，P<0.001).ConclusionThe infection model ofC.elegans-XDRKP is established successfully.

Caenorhabditiselegans； extensively drug resistance；Klebsiellapneumoniae； infection； model

2016-03-08

2010年度院長基金(2010C001)

王訊(1989-)，女(漢族)，河北省定州市人，碩士研究生，主要從事兒科感染性疾病研究。

孫樹梅E-mail:sunshumei99@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.07.004

R383.1

A

1671-9638(2016)07-0457-04