苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥及Aurora-A表達(dá)的影響

朱錦輝 陳燕 葉清煌 占小莉 王躍東

苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥及Aurora-A表達(dá)的影響

朱錦輝 陳燕 葉清煌 占小莉 王躍東

目的 探討苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥及Aurora-A表達(dá)的影響。方法 不同濃度苦參堿聯(lián)合吉西他濱處理PANC-1及其耐藥細(xì)胞株P(guān)ANC-1/R2，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞株凋亡情況；qPCR法測定Aurora-A mRNA表達(dá)。結(jié)果 流式細(xì)胞技術(shù)顯示苦參堿和吉西他濱不同給藥方式在PANC-1組和合PANC-1/R2組內(nèi)凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。qPCR結(jié)果，PANC-1組在空白對照、吉西他濱（400μg/ml）、苦參堿（8μg/ml）及吉西他濱（400μg/ml）聯(lián)合苦參堿（8μg/ml）處理后，Aurora-A mRNA表達(dá)分別是（1.001±0.041），（0.884±0.063），（0.884±0.063）和（0.957±0.084），與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；PANC-1/R2組分別是（1.835±0.072），（1.761±0.052），（1.879±0.068）和（1.910±0.086），與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 苦參堿與吉西他濱聯(lián)合作用具有誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的抗腫瘤作用，但不能逆轉(zhuǎn)胰腺癌吉西他濱耐藥的作用，不能增加化療敏感性，也不具有調(diào)節(jié)Aurora-A表達(dá)的作用。提示苦參堿可通過誘導(dǎo)凋亡途徑發(fā)揮抗胰腺癌作用，但其作用不十分顯著。

苦參堿 胰腺癌 Aurora-A 吉西他濱 耐藥

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，苦參類生物堿具有較高的抗腫瘤活性［1］，同時又具有免疫調(diào)節(jié)作用﹑升高白細(xì)胞［2］﹑止痛等常規(guī)化療藥物所不具備的優(yōu)勢，近來還發(fā)現(xiàn)其能逆轉(zhuǎn)腫瘤對化療藥物的耐藥性。研究［3，4］認(rèn)為苦參堿可通過誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡﹑下調(diào)VEGF表達(dá)等方式發(fā)揮抗腫瘤作用。雖有研究表明苦參堿具有逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥的報道，但是否能逆轉(zhuǎn)胰腺癌吉西他濱的耐藥及調(diào)節(jié)Aurora-A表達(dá)尚缺乏研究。2015年3月至9月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，探討苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥及Aurora-A表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 實(shí)驗(yàn)動物：鼠齡4周，體重18～20g的雄性BALB/c裸小鼠（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供和飼養(yǎng)）。細(xì)胞株：人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1及耐藥株P(guān)ANC-1/R2（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科研究所提供）。戊巴比妥鈉：中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品。qPCR儀：Biorad公司。

1.2細(xì)胞凋亡檢測 用不含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，取1E+5個細(xì)胞量的懸液，加入5μl Annexin V-APC，混勻后，再加入5μl 7-AAD染液，混勻，室溫，避光，反應(yīng)5～15min后置于冰上。＜1h進(jìn)行流式細(xì)胞儀機(jī)檢測。GFP的綠色熒光：FITC通道篩選GFP陽性細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-APC/7-AAD熒光檢測。Annexin V-APC的紅色熒光：激發(fā)波長633nm，最大發(fā)射波長660nm。7-AAD紅色熒光：激發(fā)波長Ex=546nm；發(fā)射波長Em=647nm。

1.3qPCR檢測 qPCR實(shí)驗(yàn)所用AMV和Tag聚合酶為 TaKaRa公司產(chǎn)品，dNTP和引物由上海生工生物工程公司提供及合成。取約50mg組織，加入1ml Trizol試劑（Gibco），按試劑說明書抽提總RNA，對獲得的RNA進(jìn)行分析和定量，取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。實(shí)驗(yàn)所用引物序列經(jīng)GeneBank網(wǎng)上驗(yàn)證，引物序列及目的片段長度見表 l。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA Marker確定產(chǎn)物。

表1　Aurora -A引物序列

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS14.0軟件。計數(shù)資料用%表示，用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

作者單位：310009 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 外科

2　結(jié)果

2.1不同濃度苦參堿和吉西他濱聯(lián)合處理對兩組細(xì)胞凋亡的影響 PANC-1組的無苦參堿無吉西他濱作用﹑吉西他濱400μg/ml而無苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度4μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度8μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度16μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度32μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度64μg/ml苦參堿作用下凋亡細(xì)胞 占15.7%﹑15.7%﹑15.2%﹑12.1%﹑17.4%﹑16% 和14.2%，PANC-1/R2組的無苦參堿無吉西他濱作用﹑吉西他濱400μg/ml而無苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度4μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度8μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度16μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度32μg/ml苦參堿作用﹑吉西他濱400μg/ml聯(lián)合濃度64μg/ml苦參堿作用下凋亡細(xì)胞占5.9%﹑6.1%﹑8.3%﹑10.0%﹑7.0%﹑7.6%和3.9%，兩組間凋亡細(xì)胞差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1﹑2。

圖1　流式細(xì)胞技術(shù)檢測PANC-1不同處理下細(xì)胞凋亡情況

圖2　流式細(xì)胞技術(shù)檢測PANC-1/R2不同處理下細(xì)胞凋亡情況

2.2苦參堿和吉西他濱對Aurora-A表達(dá)的影響 通過qPCR技術(shù)檢測PANC-1和PANC-1/R2細(xì)胞株Aurora-A mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PANC-1組在空白對照﹑吉西他濱（400μg/ml）﹑苦參堿（8μg/ml）及吉西他濱（400μg/ml）聯(lián)合苦參堿（8μg/ml）處理后，Aurora-A mRNA表達(dá)分別是（1.001±0.041）﹑（0.884±0.063）﹑（0.884±0.063） 和（0.957±0.084），與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；PANC-1/R2組分別是（1.835±0.072），（1.761±0.052），（1.879±0.068）和（1.910±0.086），與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3﹑4。

圖3　PANC-1在苦參堿和吉西他濱不同處理后Aurora-A mRNA的表達(dá)

圖4　PANC-1/R2在苦參堿和吉西他濱不同處理后Aurora-A mRNA的表達(dá)

3　討論

苦參堿是我國傳統(tǒng)中藥-苦參根提取物中的純成分之一?？鄥A是豆科植物苦參﹑苦豆子﹑廣豆根等中草藥活性成分的提取物，其化學(xué)式為C15H24 N20，屬于四環(huán)的噻嗪啶類，分子骨架為2個噻嗪啶的雜體［5］。現(xiàn)代研究表明苦參堿具有廣泛的抗腫瘤特性，涵蓋消化﹑呼吸﹑耳鼻咽喉﹑神經(jīng)﹑血液﹑內(nèi)分泌等幾乎全身的各個系統(tǒng)腫瘤［6］，如在體外其有抗鼠移植性腫瘤的作用；可誘導(dǎo)K562和SMMC-7721細(xì)胞分化；臨床也有苦參及苦參堿（如嗎特靈注射液）對白血病﹑肝癌和胃癌治療有效的報道［7］。各種研究表明苦參堿的抗腫瘤作用可以通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖﹑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化﹑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡﹑抑制腫瘤細(xì)胞粘附轉(zhuǎn)移﹑逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性和調(diào)節(jié)宿主免疫功能等方面發(fā)揮作用［8～11］。目前認(rèn)為臨床效果較確切的是血液系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，對胰腺癌的作用研究較少。侯武衛(wèi)［12］將不同濃度的苦參堿作用于培養(yǎng)的SW1990細(xì)胞，通過MTI"比色法﹑流式細(xì)胞儀和DNA凝膠電泳﹑電子顯微鏡技術(shù)觀察檢測細(xì)胞凋亡，研究分析其對SW1990細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。通過結(jié)果分析認(rèn)為苦參堿能抑制SW1990細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

本資料中濃度0﹑4﹑8﹑16﹑32﹑64μg/ml的苦參堿聯(lián)合400μg/ml吉西他濱作用于PANC-1和耐藥株P(guān)ANC-1/R2，流式細(xì)胞技術(shù)檢測PANC-1/R2在不同濃度苦參堿和吉西他濱及不同處理方式作用下的凋亡情況，結(jié)果顯示PANC-1組的各種處理下凋亡細(xì)胞比例為12.1%～17.4%，而PANC-1/R2組為3.9% ～8.3%，兩組間凋亡細(xì)胞差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但組內(nèi)的抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明吉西他濱耐藥細(xì)胞株篩選成功，但兩組中均可見不同濃度苦參堿作用下，細(xì)胞凋亡率變化不大，不具有明顯的逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。研究認(rèn)為多藥耐藥MDR的發(fā)生，主要以腫瘤細(xì)胞多藥耐藥mdrl基因表達(dá)的膜糖粘蛋白P170過度表達(dá)﹑肺耐藥蛋白LRP水平升高﹑腫瘤細(xì)胞DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TOPO Ⅱ）等相關(guān)酶活性增加［13］。文獻(xiàn)報道，苦參堿口服給藥可抑制化療誘導(dǎo)的獲得性多藥耐藥小鼠S180腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)基因P170﹑LRP的表達(dá)及TOPOⅡ活性［11］；又有研究用苦參堿作用于K562長春新堿耐藥株（K562Pvin）和K562阿霉素耐藥株（K562Pdox），其抑制率約70%，同時伴有P糖蛋白表達(dá)的下調(diào)，表明苦參堿可能通過下調(diào)糖蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而達(dá)到殺傷多藥耐藥腫瘤細(xì)胞的作用［14］。但本資料結(jié)果未發(fā)現(xiàn)耐藥逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，可能苦參堿的逆轉(zhuǎn)化療耐藥作用具有腫瘤屬性，對不同腫瘤發(fā)揮不同的作用。進(jìn)一步的研究苦參堿作用下，PANC-1/R2細(xì)胞株耐藥相關(guān)基因P170﹑LRP的表達(dá)﹑TOPOⅡ活性及P糖蛋白等的表達(dá)可進(jìn)一步明確苦參堿對胰腺癌吉西他濱耐藥的無逆轉(zhuǎn)作用。

Aurora-A激酶是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)中心體﹑微管功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在中心體成熟﹑紡錘體形成﹑染色體分離，即有絲分裂的正常進(jìn)行中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Aurora-A認(rèn)為是與腫瘤預(yù)后相關(guān)的基因之一，其表達(dá)的異常可引起細(xì)胞的過度增殖﹑與侵襲轉(zhuǎn)移﹑腫瘤細(xì)胞凋亡抑制﹑調(diào)節(jié)自噬誘導(dǎo)耐藥等［15～17］。本資料通過qPCR技術(shù)檢測PANC-1和PANC-1/R2細(xì)胞株Aurora-A mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PANC-1組在空白對照﹑吉西他濱（400μg/ml）﹑苦參堿（8μg/ml）及吉西他濱（400μg/ml）聯(lián)合苦參堿（8μg/ml）處理后，Aurora-A mRNA表達(dá)分別是（1.001±0.041），（0.884±0.063），（0.884±0.063） 和（0.957±0.084），與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；對應(yīng)的PANC-1/R2組分別是（1.835±0.072），（1.761±0.052），（1.879±0.068） 和（1.910±0.086），與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明Aurora-A在敏感和耐藥細(xì)胞間存在表達(dá)差異，但苦參堿和吉西他濱作用下在兩組中其表達(dá)無明顯改變，即使兩者聯(lián)合作用，Aurora-A表達(dá)亦無明顯改變，提示苦參堿和吉西他濱不具有直接調(diào)節(jié)Aurora-A激酶的作用。可見苦參堿聯(lián)合吉西他濱作用胰腺癌可增強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，但這種誘導(dǎo)凋亡的作用不十分強(qiáng)烈，更多的是吉西他濱的細(xì)胞毒作用，同時兩者聯(lián)合作用也不能改變Aurora-A激酶的表達(dá)。

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Objective To evaluate the effect of matrine on inducing apoptosis of pancreatic cancer cells，and regulating the expression of Aurora-A and reversing gemcitabine-resistance of pancreatic cancer. Methods Apoptosis of PANC-1 and PANC-1/R2 cells were analyzed by Flow Cytometry after treatment of matrine and gemcitabine. Aurora-A gene expression of PANC-1 / and PANC-1/R2 were analyzed by qPCR after treatment of matrine and gemcitabine. Results The outcome of Flow cytometry shows that apoptosis rates of pancreatic cells had no signifi cant difference in groups but signifi cant difference between the PANC-1 and PANC-1/R2 groups. The same phenomenon was found of Aurora-A mRNA expression in the two groups. Conclusions The combination of matrine andh gemcitabine can induce apoptosis of pancreatic cancer cells，but can not reverse the effects of gemcitabine-resistance of pancreatic cancer，can not increase sensitivity to chemotherapy，also has no impact on expression of Aurora-A. The results indicates that matrine can play a certain role of anti-pancreatic cancer by inducing apoptosis.

Matrine Pancreatic carcinoma Aurora-A Gemcitabine Resistance

浙江省中醫(yī)藥優(yōu)秀青年人才基金項(xiàng)目（2013ZQ022）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項(xiàng)目（2012KYB018）