藥敏試驗擴(kuò)散法比較分析

李雁萍，宋志勇

（山西省畜牧獸醫(yī)學(xué)校，山西 太原 030024）

藥敏試驗擴(kuò)散法比較分析

李雁萍，宋志勇

（山西省畜牧獸醫(yī)學(xué)校，山西 太原 030024）

藥敏試驗是指細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性試驗，通過藥敏試驗，能很好地掌握藥物對細(xì)菌的敏感性，為臨床選用抗菌藥物提供理論參考，以便準(zhǔn)確有效地利用藥物進(jìn)行預(yù)防治療。常用方法有紙片法、牛津杯法和打孔法等。通過對大腸桿菌的藥敏試驗，氧氟沙星、氟甲喹、新霉素為高敏，硫氰酸紅霉素、林可霉素為中敏。

抗菌藥；藥敏試驗；擴(kuò)散法；比較

抗菌藥對細(xì)菌性傳染病的預(yù)防、控制起到非常重要的作用，但因盲目、濫用抗菌藥，致使很多致病性細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，使得抗菌藥對細(xì)菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費，而且還延誤病情，給養(yǎng)殖場（戶）造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大的困惑［1］。通過藥敏試驗，能很好地掌握藥物對細(xì)菌的敏感性，為臨床選用抗菌藥物提供理論參考，以便準(zhǔn)確有效的利用藥物進(jìn)行預(yù)防治療［2］。筆者從事實驗工作30年，臨床微生物實驗室進(jìn)行藥敏試驗的方法主要是擴(kuò)散法，現(xiàn)將三種擴(kuò)散法的具體操作及試驗結(jié)果介紹總結(jié)如下，供大家臨床用藥參考。

1　材料和方法

1.1原理

藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而形成濃度梯度，由于抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC（最小抑菌濃度）呈負(fù)相關(guān)［3］。

1.2材料

1.2.1菌種

臨床現(xiàn)場采取大腸。

1.2.2抗生素和抗菌藥

選用氧氟沙星可溶性粉（編號為1）、硫氰酸紅霉素可溶性粉（編號為2）、鹽酸林可霉素可溶性粉（編號為3）、氟甲喹可溶性粉（編號為4）、硫酸新霉素可溶性粉（編號為5）5種抗菌藥進(jìn)行對比試驗。

1.3方法

1.3.1紙片法

將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上。

1.3.1.1紙片制備

取定性濾紙，用打孔機(jī)打成6 mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片200片分5份分別裝入清潔干燥的5個青霉素空瓶中，瓶口以報紙包扎。經(jīng)15磅15～2 min高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥備用。

1.3.1.2藥液的制備（用于商品藥的試驗）

挑選可溶性粉劑氧氟沙星（編號為1）、硫氰酸紅霉素（編號為2）、林可霉素（編號為3）、氟甲喹（編號為4）、新霉素（編號為5），按商品藥治療量的10倍的比例配制藥液。

1.3.1.3藥敏片的準(zhǔn)備

在上述含有40片紙片的5個青霉素瓶內(nèi)分別加入氧氟沙星可溶性粉（編號為1）、硫氰酸紅霉素可溶性粉（編號為2）、鹽酸林可霉素可溶性粉（編號為3）、氟甲喹可溶性粉（編號為4）、硫酸新霉素可溶性粉（編號為5）的0.1%藥液10 ml，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液。翻動紙片時不能將紙片搗爛，同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3～6個月。

1.3.1.4普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

稱取瓊脂培養(yǎng)基22.5 g，加入500 ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，培養(yǎng)皿分裝，在培養(yǎng)皿的皿底劃十字形，標(biāo)號（與抗菌藥物編號一致），消毒，備用。

1.3.1.5菌種的挑選、培養(yǎng)

將臨床癥狀和剖檢變化疑似大腸桿菌病的雞或豬的肝、脾、心臟，先用灼燒的手術(shù)剪在肝或心臟表面烙燙一下，剪取病料如肝、脾、心臟剪小塊直接放入肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行培養(yǎng)，備用。

1.3.1.6操作步驟

第1步，在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的鑷子夾取消毒棉，蘸取待檢細(xì)菌混懸液，涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，涂好的培養(yǎng)皿放入37℃恒溫箱中20～30 min，效果更好。

第2步，將消毒鑷子夾取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。藥敏片有規(guī)律地貼于平皿培養(yǎng)基上，每種藥敏片要與相應(yīng)的編號對應(yīng)，每組重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

第3步，將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察效果。

1.3.2牛津杯法

在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的鑷子夾取消毒棉，蘸取待檢細(xì)菌混懸液，涂布于平皿培養(yǎng)基表面。操作、要求同紙片法。

無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用塑料管、玻璃管、瓷管代替），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。

15 min后分別向各小管中滴加和藥敏片一樣量（25 μL）的各種藥液，每組重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察效果。

1.3.3打孔法

在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的鑷子夾取消毒棉，蘸取待檢細(xì)菌混懸液，涂布于平皿培養(yǎng)基表面。操作、要求同紙片法。

無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4 mm、孔徑與孔距均為3 mm，管的兩端要光滑，也可用塑料管、玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結(jié)果）。

待15 min后，分別向各孔中滴加和藥敏片一樣量（25 μL）的各種藥液。每組重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察效果。

1.3.4判定標(biāo)準(zhǔn)

藥敏試驗的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。

表1　藥物敏感試驗判定標(biāo)準(zhǔn)

2　結(jié)果觀察

運用擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示如下表。

藥物敏感試驗判定標(biāo)準(zhǔn)參考表1，氧氟沙星（編號為1）、氟甲喹（編號為4）、新霉素（編號為5）；在20 mm以上均為高敏；硫氰酸紅霉素（編號為2）、林可霉素（編號為3）在10～14 mm均為中敏。

表2　藥物敏感試驗結(jié)果

3　結(jié)論與體會

3.1結(jié)論

通過紙片法、牛津杯法和打孔法對大腸桿菌的藥敏試驗，可得出以下結(jié)論：

打孔法不需要制作或購買藥敏片，也不用購買牛津杯，成本低，適合生產(chǎn)中應(yīng)用。打孔法3組對比，結(jié)果整齊，誤差小。打孔法直接打孔后，將藥液滴入即可。

由此可見，打孔法操作簡單，成本低，準(zhǔn)確率高，適合商品藥敏感度的測定。

3.2影響藥敏試驗的因素

3.2.1培養(yǎng)基

溶解培養(yǎng)基要用蒸餾水，一些離子如Ca2+、Mg2+、Al3+等，一定程度上影響藥敏試驗的結(jié)果。

細(xì)菌藥敏試驗的培養(yǎng)基厚度大約為4 mm，若培養(yǎng)基厚度大于4 mm，會使細(xì)菌出現(xiàn)耐藥；若小于4 mm，本應(yīng)耐藥的易出現(xiàn)敏感，這一點很關(guān)鍵［4］。

3.2.2試紙片的影響

藥敏試紙片的試紙一般是使用加厚型的濾紙，藥敏紙片的厚度要求大約1 mm，這樣才有利于細(xì)菌的生長和藥物的擴(kuò)散速度。藥敏紙片的直徑在6.00～6.35 mm之間，紙片的厚度和直徑大小都會影響藥敏試驗的結(jié)果。

做好的紙片應(yīng)放低溫下（-10℃）保存，同時要避免潮濕，以保持抗菌藥物的活性。盛紙片小瓶自低溫處取出應(yīng)在室溫平衡至少10min后再打開，避免冷凝水影響藥效。

3.2.3細(xì)菌菌株的影響

由于各種菌對藥物的敏感性不同，產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小不同，如果菌種不純，試驗中所產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小與該菌種在純培養(yǎng)狀態(tài)下產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小存在較大的差異，影響判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此需要對各種致病菌提純后，分別進(jìn)行不同的藥敏試驗。藥敏試驗時，需要將提純后的菌種配制成一定濃度的菌液。WHO組織制定的標(biāo)準(zhǔn)是要求菌液濃度在1.5億/mL左右。若菌液濃度過高，該菌會對所有藥物產(chǎn)生耐藥；反之，菌液濃度過低，該菌會對所有藥物均敏感。

藥敏試驗中要將菌液均勻地涂在培養(yǎng)基上，使細(xì)菌均勻分布，這樣才能使試驗結(jié)果不會出現(xiàn)較大的偏差。涂菌后15 min才能貼藥敏紙片。由于涂菌后，細(xì)菌要有一段時間的適應(yīng)過程，但是時間不能過長，否則會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。貼藥敏紙片時，每取一種藥敏紙片必須燒一下鑷子口，避免藥敏紙片之間相互混淆，以提高藥敏的準(zhǔn)確性。藥物殺滅細(xì)菌存在一定的量比，藥敏試驗培養(yǎng)基上細(xì)菌層越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大［4］。

3.2.4培養(yǎng)時間的影響

一般培養(yǎng)溫度和時間為37℃8～18h，有些抗菌藥擴(kuò)散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2～4 h，使抗菌藥預(yù)擴(kuò)散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細(xì)菌的生長，而得到較大的抑菌圈［4］。

3.3藥敏試驗的應(yīng)用

藥物敏感試驗后，應(yīng)選擇高敏藥物進(jìn)行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細(xì)菌接觸，而在給畜禽用藥的時候，必須通過機(jī)體的吸收才能使藥物達(dá)到一定的效果，所以在給畜禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達(dá)到好的治療效果。

［1］陳學(xué)文.獸醫(yī)臨床上濫用抗生素的危害［J］.當(dāng)代畜牧，2014（27）：56～57.

［2］唐光武等.禽病快速診斷指南［M］.河南：和囔科學(xué)技術(shù)出版社，2008.4：43.

［3］倪語星.抗微生物藥物敏感性試驗規(guī)范［M］上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2002.10：16.

［4］佚名.影響藥敏試驗的因素［J］.北方牧業(yè)，2004（14）：19～19.

S859.1

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1004-5090（2016）07-0010-03

2016-04-29）