模擬微重力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞全細(xì)胞瘤苗干預(yù)A549移植瘤增殖的研究

李　靜　陳　軍　李秀玉　牛潞芳.海軍總醫(yī)院中醫(yī)科，北京　00048；.陜西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，陜西咸陽　7046

模擬微重力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞全細(xì)胞瘤苗干預(yù)A549移植瘤增殖的研究

李靜1陳軍2李秀玉1牛潞芳1
1.海軍總醫(yī)院中醫(yī)科，北京100048；2.陜西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，陜西咸陽712046

目的 比較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）于不同重力環(huán)境下獲得全細(xì)胞抗原（WCAs）對(duì)于人肺腺癌細(xì)胞株A549荷瘤的影響。方法 全骨髓貼壁法原代培養(yǎng)小鼠MSCs，采用2D回轉(zhuǎn)模式，以30 r/min水平回轉(zhuǎn)模擬微重力（MMG）培養(yǎng)條件，并以正常重力（NG）為對(duì)照培養(yǎng)MSCs；隨后以15 Gy的X線滅活MSCs獲取WCAs，將BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組，實(shí)驗(yàn)組（MMG組）皮下接種WCAs為（1次/3 d，共2周）；對(duì)照組分別為PBS組，NG組，A549組；各組均采用A549細(xì)胞系皮下移植荷瘤，觀察4組小鼠腫瘤生長情況；測量腫瘤直徑、計(jì)算腫瘤體積，并采用免疫組化法檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)。結(jié)果 肺腺癌A549細(xì)胞皮下移植使小鼠成功荷瘤，MMG可促進(jìn)WCAs抑制移植瘤的生長。MMG組腫瘤體積顯著小于PBS組與NG組（P＜0.05）；NG組及MMG組的腫瘤至第6天方見生長，MMG組移植瘤體積顯著小于NG組（P＜0.05）。同時(shí)，A459組的抑制作用最強(qiáng)；PBS組腫瘤最大；12 d對(duì)各組移植瘤稱重，其中NG組為（458.7±21.6）g，MMG組為（315.6±18.5）g，MMG組的抑制作用顯著高于NG組（P＜0.05）。HRP標(biāo)記染色提示MMG可增強(qiáng)WCAs的免疫刺激，使得PCNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論采用MSCs獲得WCAs進(jìn)行免疫應(yīng)激可產(chǎn)生抑制腫瘤生長作用，MMG可加強(qiáng)其抑瘤作用，能顯著觀察到PCNA表達(dá)下調(diào)，其內(nèi)在的免疫分子機(jī)制有待深層次的探索。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腫瘤；模擬微重力

有關(guān)腫瘤發(fā)生“胚胎”屬性的認(rèn)識(shí)由來已久，“cancer”源于古希臘語，意味著“anaplasia（返祖）”，其內(nèi)涵就是“to from backwards（回到起點(diǎn)）”。去分化（dedifferentiation）屬性，指某種情況下，一些細(xì)胞失去它原本所在組織的結(jié)構(gòu)和功能，成為一個(gè)具有未分化細(xì)胞特征的細(xì)胞，而具備這種特性的細(xì)胞往往都是腫瘤細(xì)胞［1］。正是基于此設(shè)想，一百多年來，研究人員嘗試采用胚胎組織進(jìn)行裂解獲得瘤苗抗原，評(píng)估其對(duì)移植瘤抑瘤效果并取得初步結(jié)論［2］，即干細(xì)胞或胚胎組織的粗抗原可產(chǎn)生類似腫瘤疫苗的作用。本研究組早前也初步摸索，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）獲得全細(xì)胞抗原 （whole cell antigens，WCAs）可以產(chǎn)生抑瘤作用［3-4］。進(jìn)一步評(píng)估發(fā)現(xiàn)，通常條件下MSCs瘤苗的抑瘤效率低，這可能將成為制約瓶頸有待突破。因此，探索可以提高全細(xì)胞瘤苗免疫原性的方法或策略顯得尤為迫切。本研究采用模擬微重力（MMG）干預(yù)MSCs全細(xì)胞抗原后進(jìn)行免疫接種，評(píng)估比較不同重力模式下MSCs的WCAs的抑瘤作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

BALB/c系小鼠（合格證號(hào)：軍KS-2012-0004，軍事醫(yī)學(xué)科院動(dòng)物中心）；CO2恒溫培養(yǎng)箱 （Thermo 140型，美國HERA cell），普通離心機(jī)（HDL-40B型，成都科學(xué)儀器廠），2D回轉(zhuǎn)儀（中國科學(xué)院），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Labofuge 400R型號(hào)，德國Heraeus），倒置顯微鏡（CKX31型，日本Olympus）；低糖DMEM（美國Hyclone），胎牛血清 （美國Hyclone），PCNA-鼠單抗（美國Abcom），辣根過氧化物酶（HRP）-二抗（北京中杉公司）。

1.2方法

1.2.1MSCs、A549培養(yǎng)與全細(xì)胞抗原的制備

1.2.1.1MSCs全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs，6周齡小鼠的股骨和脛骨，10%FBS-低糖DMEM沖出骨髓，接種于培養(yǎng)瓶里，24～48 h后去懸浮，每3～4天換液，直至需要傳代。

1.2.1.2人肺腺癌A549細(xì)胞從液氮罐中取出A549細(xì)胞凍存管，放入37℃水浴鍋中解凍，1000 r/min離心5 min，PBS吹打、離心后，以10%FBS+5%RPMI-1640培養(yǎng)，2～3 d換液，直到需要傳代。

1.2.1.3MSCs全細(xì)胞抗原制備X線照射裂解法獲得抗原，調(diào)整3～5代A549細(xì)胞密度為1×106，于培養(yǎng)皿中行X線照射，強(qiáng)度為15 Gy，時(shí)間30 s；照射后的抗原4℃保存不超過6 h。

1.2.2CCK8細(xì)胞活力檢測

在96孔板中接種濃度為2×104個(gè)/孔的2種細(xì)胞（MMG與NG分別培養(yǎng)的MSCs）懸液，置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃，5%CO2）；接種細(xì)胞后分別于第3、6、9、12天加入10μLCCK8溶液；培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.3MMG干預(yù)

采用2D回轉(zhuǎn)模擬微重力培養(yǎng)條件［5-6］，MSCs細(xì)胞分為MMG組與正常重力（NG）對(duì)照組，MMG組細(xì)胞上回轉(zhuǎn)儀上模擬失重（經(jīng)計(jì)算以30 r/min為最佳效果），在此回轉(zhuǎn)條件下重力及切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響會(huì)降至最低［7］。MSCs長至融合后，消化細(xì)胞接種于蓋玻片上，隨后置于6孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔；貼壁后上回轉(zhuǎn)倉，將爬片插入到特制的Fixing鐵架上，每個(gè)鐵架相應(yīng)放入4個(gè)玻片，置于小室，加入培養(yǎng)基（37℃，10%低糖DMEM）；擰緊蓋子安裝至回轉(zhuǎn)器上，整個(gè)回轉(zhuǎn)系統(tǒng)放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱，以30 r/min旋轉(zhuǎn)回轉(zhuǎn)48 h。NG對(duì)照組所有操作相同，即爬片后入小室，但小室不上回轉(zhuǎn)器。

1.2.4移植瘤荷瘤造模及實(shí)驗(yàn)分組

選擇3～4周齡雄性小鼠，每組6只。依據(jù)免疫應(yīng)激抗原的不同分為4組：PBS組、A549組（A549裂解獲得WACs）、MMG組（MMG干預(yù)后MSCs裂解獲得WACs）、NG組（NG干預(yù)后MSCs裂解獲得WACs），實(shí)驗(yàn)組為MMG組，余3組為對(duì)照。NG組與A549組小鼠每3天接受1次皮下注射瘤苗刺激（抗原液加PBS 共2mL），2周后（共5次）進(jìn)行腫瘤荷瘤造模。PBS組每3天接受1次皮下注射2 mL的PBS，2周后荷瘤造模。整體實(shí)驗(yàn)流程詳見圖1。

圖1　實(shí)驗(yàn)流程圖

1.2.5A549皮下移植造模及腫瘤測量

1.2.5.1造模獲得復(fù)蘇后3～4代A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106接種小鼠上肢下方（腋窩下）皮膚。

1.2.5.2測量按皮下腫瘤體積及形狀進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，接種后分別于3、6、9、12 d觀察腫瘤增長，測量最長徑與最短徑，計(jì)算腫瘤體積，公式為V=1/6πab2（a為長徑，b為短徑），單位為毫米（mm）。并在12 d處死小鼠，切下腫瘤，電子秤稱量腫瘤的重量，單位為克（g）。

1.2.6HE染色及PCNA的表達(dá)

12 d獲取腫瘤組織，固定、脫水、包埋、切片。

1.2.6.1HE染色切片蒸餾水漂洗入蘇木精染色，酸水及氨水中分色；自來水沖洗過蒸餾水；分別入酒精中脫水，伊紅染色液染色；脫水、透明、封固。

1.2.6.2免疫組化 二甲苯脫蠟，入3%H2O2浸泡10min抗原修復(fù)，5%BSA封閉，加一抗，4°C過夜；PBS沖洗，加上HRP標(biāo)記二抗，然后37°C孵育半小時(shí)；顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、封片。

1.2.6.3結(jié)果觀察倒置顯微鏡下，伊紅淡染示細(xì)胞漿，胞核被藍(lán)色復(fù)染記一個(gè)完整細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上記錄HRP標(biāo)記（褐色沉淀）記錄陽性細(xì)胞數(shù)，于10倍下觀察，分別取3個(gè)視野后計(jì)數(shù)平均數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 14.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MMG干預(yù)MSCs的細(xì)胞形態(tài)和增殖情況

在NG組（正常對(duì)照），爬片1d即可見較多細(xì)胞貼壁，呈紡錘形和多角形，可見細(xì)胞核；而MMG組采用MMG干預(yù)后細(xì)胞出現(xiàn)“圓形”改變，細(xì)胞間距增大，排列稀疏。見圖2。本研究采用CCK8檢測細(xì)胞活力，于第3、6、9、12天分析OD值，具體見圖2；提示MMG可影響細(xì)胞增殖。

2.2MMG上調(diào)MSCs的WCAs抑瘤作用

本研究分別獲得NG及MMG條件下MSCs的WCAs，以WCAs刺激小鼠獲得免疫應(yīng)激模型，同時(shí)以A549細(xì)胞及PBS行實(shí)驗(yàn)對(duì)照；其中陽性對(duì)照組的WCAs抑制最強(qiáng)。3 d時(shí)，4組均未觀察到明顯的腫瘤產(chǎn)生。6 d時(shí)，A549組未觀察到明顯的腫瘤產(chǎn)生，PBS組體積［（45.5±16.4）mm3］，MMG組［（19.03±6.5）mm3］，NG組［（26.4±9.2）mm3］，與NG組比較，PBS組增大（P＜0.05），MMG組減小（P＜0.05）；與MMG組比較，PBS組與NG組均增大（P＜0.05）。9 d時(shí)，A549組未有腫瘤產(chǎn)生，PBS組體積［（83.5±12.6）mm3］，MMG組［（26.7±5.9）mm3］，NG組［（57.7±10.2）mm3］，與NG組比較，PBS組明顯增大 （P＜0.05），MMG組明顯減?。≒ ＜0.05）；與MMG組比較，PBS與NG組均增大 （P＜0.05）。12 d時(shí)，A549組腫瘤體積［（6.03±1.21）mm3］，PBS組體積［（138.7±9.4）mm3］，MMG組［（41.9±8.1）mm3］，NG組［（79.7±12.4）mm3］；與A549組比較，其余組別移植瘤均增大（P＜0.05）；與PBS組比較，各組體積均減?。≒＜0.05）；與 NG組比較，PBS組明顯增大（P＜0.05），MMG組與A549組明顯減小 （P＜0.05）；與MMG組比較，A549組較小 （P＜0.05），PBS組與NG組均增大（P＜0.05）。見表1。

圖2　MMG對(duì)細(xì)胞增殖的影響

12 d處死小鼠切下移植瘤進(jìn)行稱重，PBS組［（892.3±10.6）g］，NG組［（458.7±21.6）g］，MMG組［（315.6± 18.5）g］，A549組［（114.2±16.7）g］，與A549組比較，其余組別移植瘤均增大（P＜0.05）；與PBS組比較，各組體積均減?。≒＜0.05）；與NG組比較，PBS組明顯增大（P＜0.05），MMG組與A549組明顯減?。≒＜0.05）；與MMG組比較，A549組較小 （P＜0.05），PBS組與NG組均增大（P＜0.05）。見圖3。

表1　MMG對(duì)MSCs瘤苗抑瘤體積的影響（mm3，±s）

表1　MMG對(duì)MSCs瘤苗抑瘤體積的影響（mm3，±s）

注：與PBS組比較，#P＜0.05；與NG組比較，△P＜0.05；與MMG組比較，▲P＜0.05；與A549組比較，*P＜0.05

組別　3 d　6 d　9 d　12 d PBS組NG組MMG組A549組0000 45.5±16.4#26.4±9.2△19.0±6.5▲0 83.5±12.6#57.7±10.2△26.7±5.9▲0 138.7±9.4#79.7±12.4△41.9±8.1▲6.0±1.2*

圖3　MMG對(duì)MSC s瘤苗抑瘤1 2 d質(zhì)量的影響

2.3MMG抑制移植瘤區(qū)PCNA的表達(dá)

獲取12 d的腫瘤組織，石蠟包埋切片后行PCNA組化染色（圖4a），并HE染色，可以看到均勻分布的腺癌細(xì)胞，胞漿紅染（圖4c）；其表達(dá)均數(shù)為：PBS組為（122.3±0.1）個(gè)，A549組為（31.6±0.1）個(gè)，NG組為（77.5± 0.1）個(gè)，MMG組為（60.2±0.1）個(gè)。與PBS組比較，其他組PCNA細(xì)胞均降低（P＜0.05；與NG組比較，MMG組、A549組PCNA細(xì)胞降低（P＜0.05），PBS組升高（P ＜0.05）；與MMG比較，A549組PCNA表達(dá)稍低（P＜0.05），NG組與PBS組均升高（P＜0.05）；與A549組比較，其他組表達(dá)均升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4　瘤體PCNA表達(dá)情況

3　討論

腫瘤組織的異質(zhì)性與其去分化屬性高度相關(guān)，系指在某種情況下，一些細(xì)胞失去它所在組織的結(jié)構(gòu)和功能，呈現(xiàn)未分化特征，這些屬性其實(shí)就是胚胎屬性［9］。病理學(xué)家經(jīng)常通過評(píng)估比較靶細(xì)胞與本體組織的胚胎屬性標(biāo)識(shí)該腫瘤的分化程度，腫瘤細(xì)胞越接近于胚胎屬性其惡性程度往往越高［10］。正是這種腫瘤起源的探索［12］，人們猜想采用胚胎組織或可實(shí)現(xiàn)腫瘤的預(yù)防接種，然而此類探索一直未得到有效突破，直到近年來干細(xì)胞理念和技術(shù)的進(jìn)步，使得人們真正地論證了干細(xì)胞瘤苗的腫瘤預(yù)防接種作用。

2009年Li等［2］首次采用胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESs）作為免疫種子，發(fā)現(xiàn)其對(duì)結(jié)腸癌株CT26的移植瘤有明顯的抑制作用；隨后又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ESs對(duì)肺腺癌細(xì)胞的移植瘤也有明顯的抑制作用。進(jìn)一步的研究表明，該抑制機(jī)制可能與T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（cytotoxic T lymphocyte response，CTLs）上調(diào)高度相關(guān)［11］。由于倫理及培養(yǎng)條件的顯著ES地腫瘤全細(xì)胞疫苗的研究面臨許多挑戰(zhàn)。

近兩年，本項(xiàng)目組對(duì)成體干細(xì)胞——MSCs的免疫抑瘤作用進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)其同樣具有抑瘤接種作用［3］。研究證實(shí)，MMG可使得細(xì)胞呈現(xiàn)巨大改變，那么是否可以改變其WACs特性呢？本文旨在分析MMG作用下，MSCs的WACs作用改變的情況。本項(xiàng)目之所以構(gòu)建A549組源瘤模型，是源于20世紀(jì)腫瘤WCAs“專職”免疫抑制的假說［10］，采用干細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行比較一方面可以間接比較MSCs的抑瘤作用；另對(duì)于腫瘤的預(yù)防可能更具有潛在的臨床意義。

在重力消失的情況下，組織、細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生與正常地球重力作用下迥異的結(jié)構(gòu)與功能，并且研究人員已經(jīng)利用這種差異推行在組織工程學(xué)中［16］，而其模擬方式，無論是一維、二維或三維，都是選擇合適的速度進(jìn)行回轉(zhuǎn)來最大程度地減輕重力的影響［17-18］；本研究團(tuán)隊(duì)長期進(jìn)行細(xì)胞空間動(dòng)力的研究，以二維回轉(zhuǎn)培養(yǎng)為主，反復(fù)驗(yàn)證其結(jié)果可靠［6，8］。本次研究中，將MSCs采用MMG干預(yù)48 h后通過X線裂解獲得WCAs；較之正常對(duì)照組，MMG組的抑瘤作用提高。本研究顯示早期接種3 d的腫瘤增殖無明顯改變，但是隨著時(shí)間的延長至第6天時(shí)其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有學(xué)者曾分析了ESs腫瘤增殖改變情況，發(fā)現(xiàn)疫苗接種后隨著時(shí)間延長，腫瘤抑制愈明顯；并深入分析不同腫瘤負(fù)荷程度下干細(xì)胞瘤苗抑瘤的差異，認(rèn)為低負(fù)荷組腫瘤抑制效果更為顯著［15］。本研究切下移植瘤分析其重量和形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量的改變與體積的改變同步，提示腫瘤內(nèi)部尚未存在空洞或液化等干擾因素，但是需要進(jìn)一步采用小動(dòng)物影像攝像進(jìn)一步證實(shí)［16］。PCNA在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用［17］，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的敏感指標(biāo)［18-20］，本研究發(fā)現(xiàn)，MMG 組PCNA的表達(dá)較NG對(duì)照組更低，提示腫瘤抑制率提高。本研究初步分析MMG可提高M(jìn)SCs全細(xì)胞抗原的抑瘤能力并可直接抑制細(xì)胞增殖。

在獲得這些初步數(shù)據(jù)后，更多的疑問擺在面前，MSCs抑瘤的作用是否也與CTL作用有關(guān)？MMG是否也是通過該途徑的變化發(fā)揮其作用的？MMG是否有長效抑瘤的作用，是否能觸發(fā)機(jī)體長效的免疫“記憶”。因此，此后本項(xiàng)目組將針對(duì)這些突出問題開展進(jìn)一步研究。

［1］Mendoza PR，Specht CS，Hubbard GB，et al.Histopathologic grading of anaplasia in retinoblastoma［J］.Am JOphthalmol，2015，159（4）：764-776.

［2］LiY，Zeng H，Xu RH，et al.Vaccination with human pluripotent stem cells generates a broad spectrum of immunological and clinical responses against colon cancer［J］.Stem Cells，2009，27（12）：3103-3111.

［3］李靜，陳軍，李秀玉.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞全細(xì)胞抗原干預(yù)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549移植瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（22）：4-8.

［4］李靜，陳軍，錢彥方，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞全細(xì)胞抗原干預(yù)移植瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，15（4）：610-613，621.

［5］李靜，陳軍，錢彥方，等.紅花苷對(duì)模擬微重力下細(xì)胞遷移的作用［J］.中醫(yī)雜志，2013，54（1）：55-58.

［6］Braunecker S，Douglas B，Hinkelbein J.Comparison of different techniques for in microgravity-a simple mathematic estimation of cardiopulmonary resuscitation quality for space environment［J］.Am J Emerg Med，2015，33（7）：920-924.

［7］李靜，陳軍，錢彥方，等.模擬微重力對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏著斑形成及整合素表達(dá)的研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（29）：5625-5630.

［8］Stadtfeld M，Maherali N，Breault DT，et al.Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse［J］.Cell Stem Cell，2008，2（3）：230-240.

［9］Jabari S，Meissnitzer M，Quint K，et al.Cellular plasticity of trans-and dedifferentiation markers in human hepatoma cells in vitro and in vivo［J］.Int J Oncol，2009，35（1）：69-80.

［10］Kuppers R.The biology of Hodgkin's lymphoma［J］.Nat Rev Cancer，2009，9（1）：15-27.

［11］Yaddanapudi K，Mitchell RA，Putty K，et al.Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer：is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible［J］.PLoS One，2012，7（7）：e42289.

［12］季曉昕，李鐸，李非.微重力反應(yīng)器在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用［J］.國外醫(yī)學(xué)：生物醫(yī)學(xué)工程分冊，2004，27（3）：161-164.

［13］杜挺媛，張舒，曹新生，等.流體剪切應(yīng)力對(duì)模擬微重力下MG-63細(xì)胞骨架系統(tǒng)的影響［J］.航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2012，25（4）：235-238.

［14］戴鐘銓，李瑩輝，丁柏，等.回轉(zhuǎn)對(duì)COL1A1-EGFP基因表達(dá)的影響［J］.中國科學(xué)：C輯，2004，34（1）：68-74.

［15］DongW，Du J，Shen H，et al.Administration of embryonic stem cells generates effective antitumor immunity in mice with minor and heavy tumor load［J］.Cancer Immunol Immunother，2010，59（11）：1697-1705.

［16］Savai R，Langheinrich AC，Schermuly RT，et al.Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer［J］.Neoplasia，2009，11（1）：48-56.

［17］Whittom A，Villarreal A，Soni M，et al.Markers of apoptosis induction and proliferation in the orbitofrontal cortex in alcohol dependence［J］.Alcohol Clin Exp Res，2014，38（11）：2790-2799.

［18］Birey F，Aguirre A.Age-dependent Netrin-1 signaling regulates NG2+glial cell spatial homeostasis in normal adult graymatter［J］.JNeurosci，2015，35（17）：6946-6951.

［19］Whittom A，Villarreal A，SoniM，etal.Markers of apoptosis induction and proliferation in the orbitofrontal cortex in alcohol dependence［J］.Alcohol Clin Exp R，2014，38 （11）：2790-2799.

［20］Polotskaia A，Xiao G，Reynoso K，et al.Proteome-wide analysis of mutant p53 targets in breast cancer identifies new levels of gain-of-function that influence PARP，PCNA，and MCM4［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2015，112 （11）：1220-1229.

Study of simulated microgravity affecting antitumor response of mesenchymal stem cells against A549 transplantation tumor

LI Jing1CHEN Jun2LI Xiuyu1NIU Lufang1
1.Department of Traditional Chinese Medicine，PLA Navy General Hospital，Beijing100048，China；2.Department of Acupuncture and Massage，Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi Province，Xianyang712046，China

Objective To estimate the whole cell antigens（WCAs）of mesenchymal stem cells（MSCs）cultured in different gravity can generate different immune response against cancer in mice which induced by lung cancer cell line A549.Methods The MSCs was isolated and cultured adherent cells from marrow and a 2-dimensional clinostat（2D clinostat）was used to keep cells in continuous 2D rotation at a speed of 30 r/min around the horizontal axis，to mimc the microgravity（MMG），and the normal gravity（NG）was used as control.And then MSCs was to irradiate to X-ray（15Gy）to get the WCAs.The experiment group （MMG group）was immunized with WACs（once/3 d，2 weeks）and then the mice were challenged with A549 cells；the control mice immunized subcutaneously with PBS control（PBS group），MSCs-NG control（NG group）and A549 control（A549 group），mice were monitored for their tumor growth by measure the diameter；then the weight and volume was plotted；the expression of PCNA was monitored by immunohistochemisty. Results A well-established lung cancer（A549）model was established，MMG could improve the immune responses against A549 lung carcinoma（P＜0.05）.The A549 group had strongest inhibit effect，while the PBS group had the biggst tumor，the tumor of MMG group and NG group were found beginning to grow until 6 d；and the size in MMG group was smaller than NG group（P＜0.05）；the weight of tumor were measured on 12 d，it showed that the weight of NG group was（458.7±21.6）g，while in MMG was（315.6±18.5）g；the resist effet in MMG group was bigger than NG group （P＜0.05）.HRP stain showed MMG could down-regulated the PCNA expression（P＜0.05）.Conclusion Immunization of with MSCs getting WCAs can suppress tumor growth，MMG can enhance this suppressing effect，it can be observed PCNA expression down，the further immune mechanism need more exploring.

Mesenchymal stem cells；Cancer；Modeled microgravity

R734.2

A

1673-7210（2016）01（c）-0008-05

2015-10-25本文編輯：蘇暢）

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（8110 2678）。

李靜（1981-），女，博士；研究方向：惡性腫瘤的中醫(yī)治療。