口蝦蛄染色體核型分析及DNA含量

劉海映，楊碩，閆紅偉，周賀，劉奇，林原，李成久，郭良勇

口蝦蛄染色體核型分析及DNA含量

劉海映1、2，楊碩1、2，閆紅偉3，周賀3，劉奇1、2，林原4，李成久4，郭良勇4

（1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋牧場(chǎng)工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023；2.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；4.遼寧省水產(chǎn)苗種管理局，遼寧大連116015）

為了解口蝦蛄Oratosquilla oratoria核型組成及DNA含量，以野生口蝦蛄為材料，采用秋水仙素內(nèi)注射法，取其肝胰腺組織經(jīng)低滲和固定后，獲得染色體標(biāo)本，并對(duì)其染色體核型進(jìn)行了分析，以雞血細(xì)胞DNA為標(biāo)準(zhǔn)，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定口蝦蛄不同組織的DNA含量。結(jié)果表明：口蝦蛄二倍體染色體數(shù)目為88，即2n=88，核型組成公式為2n=62m+12sm+14t，染色體總臂數(shù) （NF）為162；口蝦蛄不同組織的DNA含量有顯著性差異 （P＜0.05），各組織DNA含量從大到小依次為肌肉＞精巢＞卵巢＞肝胰腺＞血液，肌肉組織含量最高，為10.43 pg/2c，血液含量最低，為8.70 pg/2c，各組織DNA含量平均為9.61 pg/2c；以1 pg=978 Mbp計(jì)算，首次成功估算了口蝦蛄基因組大小約為9398.58 Mbp。本研究結(jié)果可為口蝦蛄種質(zhì)資源保護(hù)及未來人工養(yǎng)殖研究提供基礎(chǔ)資料。

口蝦蛄；染色體；核型；DNA含量

染色體是生物遺傳物質(zhì)的載體，對(duì)染色體核型、帶型的研究不僅有助于揭示生物的遺傳組成［5］，還可以從生物進(jìn)化角度探討物種間的分類地位及親緣關(guān)系［6］，隨著基因組學(xué)的發(fā)展，染色體組型分析作為全基因測(cè)序的基礎(chǔ)，對(duì)了解生物的進(jìn)化地位及重要功能基因定位有著重要意義［7］。

早在 19世紀(jì)，Carnoy就首次報(bào)道了褐蝦Crangon cataphractus的染色體類型，盡管對(duì)十足目染色體研究已有一百余年，但目前已報(bào)道過的十足目核型組成也僅占已知十足目種類的0.9%。王青等［8］、相建海［9］、戴繼勛等［10］認(rèn)為：對(duì)十足目染色體研究緩慢的原因在于染色體數(shù)目多，染色體形態(tài)小不易辨認(rèn)，分裂相不易獲得等。就蝦蛄科種類而言，染色體數(shù)目與核型研究至今尚未見報(bào)道。因此，以口蝦蛄為研究材料，對(duì)其染色體數(shù)目與核型進(jìn)行研究，不僅對(duì)口蝦蛄的細(xì)胞遺傳學(xué)和人工繁育研究具有重大意義，也可為蝦蛄科其他種類的染色體研究提供基礎(chǔ)資料。

基因組大小 （DNA含量或C值）是鑒定種質(zhì)的一個(gè)重要內(nèi)容［11］，物種DNA含量的大小可以反映出該物種的進(jìn)化地位，也是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，因此，研究生物DNA含量具有重要的意義。目前，測(cè)定物種基因組大小的方法主要有熒光定量分析法［12］、孚爾根染色法［13］、二苯胺［14］、流式細(xì)胞術(shù)法［15］等。流式細(xì)胞術(shù)是近30年來發(fā)展起來的先進(jìn)技術(shù)，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞逐一進(jìn)行高速準(zhǔn)確定量分析并分類［16］，該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)量大、測(cè)量結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，是測(cè)定DNA含量的主流檢測(cè)手段［17］。

本研究中，采用Giemsa染色法對(duì)口蝦蛄肝胰腺組織進(jìn)行了核型分析，并采用流式細(xì)胞儀（Patec III，德國）對(duì)口蝦蛄血液、肌肉、肝胰腺、卵巢、精巢5種不同組織進(jìn)行DNA含量測(cè)定，同時(shí)評(píng)估其基因組大小，以期為口蝦蛄細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用口蝦蛄采自遼寧省大連市黑石礁海區(qū)，均為性腺發(fā)育成熟的野生個(gè)體，共78尾，其中雌蝦38尾，雄蝦40尾，體質(zhì)量為25～42 g。活體運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后置于25℃循環(huán)水槽中暫養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1染色體的制備 往口蝦蛄心孔中慢慢注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的秋水仙素 ［劑量為6 μg/g（體質(zhì)量）］，注射后的口蝦蛄放在充氧的水槽中暫養(yǎng)2.5 h后解剖。取其肝胰腺并置于生理鹽水中經(jīng)多次漂洗［9，18］，加入0.8%的檸檬酸溶液，在室溫下低滲40～45 min，低滲后再放入固定液 （V甲醇∶V冰醋酸=9∶1）處理7～10 min，然后轉(zhuǎn)入冰醋酸中放置1 min，經(jīng)卡諾氏固定液 （V甲醇∶V冰醋酸=3∶1）固定2～3次，每次處理15 min，樣品處理完畢后放入冰箱中冷凍過夜。同時(shí)采用冷滴片法制片，室內(nèi)干燥過夜。完全干燥的染色體玻片用10%的Giemsa液染色40 min，自然干燥后鏡檢。選取圖像清晰、染色體分散較好的中期分裂相計(jì)數(shù)，用以確定染色體數(shù)目，根據(jù)Levan等［19］的方法進(jìn)行染色體配對(duì)及核型分析，染色體相對(duì)長度計(jì)算公式為

分析： 雙子葉植物過量吸收生長素類似物后，形成層的細(xì)胞分生能力加強(qiáng)，產(chǎn)生腫脹，破壞了韌皮部的運(yùn)輸功能，使植物因有機(jī)物運(yùn)輸受阻而死。同時(shí)，這還破壞了植物正常的代謝，使植物呼吸作用加強(qiáng)，但不會(huì)產(chǎn)生ATP，造成植物細(xì)胞的損傷并浪費(fèi)大量能量[5]。正常的生長素則容易被植物代謝掉，不會(huì)產(chǎn)生此危害。單子葉植物因能迅速使人工生長素類似物失活，所以除草劑也不會(huì)對(duì)單子葉植物產(chǎn)生效果。

相對(duì)長度=實(shí)測(cè)長度/全部染色體長度總和×100。1.2.2 DNA含量的測(cè)定 雞紅細(xì)胞的制備：取雄性健康1齡公雞，在翅膀下方靜脈處采集血液，加入PBS緩沖液，以1500 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)該步驟3次，將最終雞紅細(xì)胞懸濁液固定在含有2.5%戊二醛的PBS緩沖液中，并利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)得細(xì)胞密度為2.8×107cells/mL，將獲得的雞紅細(xì)胞置于冰箱 （4℃）中保存?zhèn)溆茫?0］。

取口蝦蛄血液、肌肉、肝胰腺、卵巢、精巢組織各20個(gè)有效分析樣品。將樣品分別加入細(xì)胞裂解液，經(jīng)震蕩后靜置10 min，使用DAPI染色，然后采用流式細(xì)胞儀對(duì)口蝦蛄DNA含量進(jìn)行測(cè)量。以雞血細(xì)胞DNA含量2.5 pg/2c為標(biāo)準(zhǔn)［21］，比較口蝦蛄各組織樣品與雞血2n峰的相對(duì)位置，從而計(jì)算口蝦蛄不同組織的DNA含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用 SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較法，顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1口蝦蛄體細(xì)胞的染色體數(shù)目

本試驗(yàn)中，對(duì)104個(gè)分散良好、染色體形態(tài)清晰的肝胰腺組織中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，染色體數(shù)目為88的分裂相最多，為66個(gè)，占總數(shù)的63.46% （圖1），由此可確定，口蝦蛄肝胰腺組織的二倍體染色體數(shù)目為88，即2n=88。

圖1　口蝦蛄中期分裂相染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖Fig.1 Frequency distribution of chromosome counts recorded in 104 metaphases of mantis shrimp Oratosquilla oratoria

2.2染色體核型

本試驗(yàn)中，口蝦蛄有31對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體（m）、6對(duì)亞中部著絲點(diǎn)染色體 （sm）和7對(duì)端部著絲點(diǎn)染色體 （t）（圖2），染色體臂數(shù) （NF）為162（圖3），即口蝦蛄染色體核型公式為：2n= 62m+12sm+14t，NF=162。對(duì)中期分裂相觀察發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄染色體的大小差異較大，最大染色體相對(duì)長度為3.999，最小染色體相對(duì)長度為1.623，未發(fā)現(xiàn)與性別相關(guān)的異型染色體。染色體核型分析結(jié)果見表1。

2.3口蝦蛄不同組織的DNA含量

以雞血細(xì)胞DNA含量為參比，口蝦蛄各個(gè)組織DNA相對(duì)含量峰值如圖4所示，不同組織細(xì)胞核DNA相對(duì)含量大小依次為肌肉＞精巢＞卵巢＞肝胰腺＞血液?？谖r蛄不同組織的DNA絕對(duì)含量平均值為9.61 pg/2c（表2），此外，以1 pg=978 Mbp計(jì)算［22］，本研究中發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄基因組平均大小約為9398.58 Mbp。

圖2　口蝦蛄染色體的中期分裂相和核型Fig.2 Chromosomes metaphase and karyotype in mantis shrimp Oratosquilla oratoria

圖3　口蝦蛄核型模式圖Fig.3 Ideograms showing lengths and shapes of chromosomes in mantis shrimp Oratosquilla oratoria

表1　口蝦蛄的核型參數(shù) （平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.1 Karyotype indices of mantis shrimp Oratosquilla oratoria（mean±S.D.）

通過對(duì)口蝦蛄5種組織的DNA含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，精巢組織的DNA相對(duì)含量直方圖具有雙峰現(xiàn)象 （圖4-E），這可能是由所分析的精巢組織中存在大量單倍體精子、精細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞（n），以及少量的二倍體精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞（2n）所致。5種組織的DNA含量大小依次為肌肉細(xì)胞＞精巢二倍體細(xì)胞＞卵巢細(xì)胞＞肝胰腺細(xì)胞＞血液細(xì)胞 （表2）。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄不同組織的DNA含量有極顯著性差異 （P＜0.01）。Duncan多重比較結(jié)果表明，肌肉和精巢組織的DNA相對(duì)含量較高，均顯著高于其他組織 （P＜ 0.05）；而血液DNA含量最低，顯著低于除肝胰腺組織外的其他組織 （P＜0.05）。各組織DNA含量的差異性見表2。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在幾種被測(cè)組織中，用流式細(xì)胞儀測(cè)量的結(jié)果有一定量的雜峰出現(xiàn)，表明這種組織在制備細(xì)胞懸液時(shí)破碎細(xì)胞較多（圖4）。

圖4　口蝦蛄各組織的DNA相對(duì)含量直方圖Fig.4 Relative nuclear DNA contents in different tissues in mantis shrimp Oratosquilla oratoria

表2　口蝦蛄各組織的DNA含量Tab.2 DNA contents in different tissues in mantis shrimp Oratosquilla oratoria

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄肝胰腺組織中染色體數(shù)目為88條，與十足目中的對(duì)蝦科褐美對(duì)蝦Farfantupenaeus aztecus、桃紅美對(duì)蝦Farfantupenaeus durarum、西方濱對(duì)蝦Litopenaeus occidental、中國明對(duì)蝦 Fennempenaeus orimtalis、墨吉明對(duì)蝦 Fenneropenaeus merguiensis、長毛明對(duì)蝦Fenneropenaeus penicillatus、斑節(jié)對(duì)蝦Penaeus monodon、近緣新對(duì)蝦Metapenaeus affinis的染色體數(shù)目相同，與對(duì)蝦科其他物種染色體數(shù)目相差較小，而與十足目其他科物種染色體數(shù)目差別較大［4］?？紤]到染色體數(shù)目及組成是親緣關(guān)系遠(yuǎn)近及物種進(jìn)化判斷的重要依據(jù)，本研究結(jié)果可能暗示蝦蛄科的口蝦蛄與對(duì)蝦科親緣關(guān)系較近。Murofuehi等［23］認(rèn)為，染色體數(shù)目少的核型較為原始，口蝦蛄染色體數(shù)目比長臂蝦科Palaemonidae、海鰲蝦科Nephropidae和龍蝦科Palinuridae染色體數(shù)目少，并且核型組成相似。因此，口蝦蛄的進(jìn)化地位較長臂蝦科、海鰲蝦科和龍蝦科更為原始，有關(guān)具體的分類地位，尚待構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行進(jìn)一步分析。

本研究中發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄有絲分裂中期，染色體核型大多呈棒狀，在其他十足目動(dòng)物中，上述染色體形態(tài)也比較普遍，如中國對(duì)蝦 Fenneropenaeus chinensis［9-10］、日本沼蝦Macrobrachiumnipponense［24］、克氏螯蝦 Procambarus clarkii［25］，這給染色體分析帶來了一定的難度。一般認(rèn)為，染色體數(shù)目出現(xiàn)的百分率＞85%的眾數(shù)為該物種的染色體數(shù)［8］，考慮到大部分甲殼類染色體眾數(shù)百分比低于85%，如刀額新對(duì)蝦metapenaeus ensis［26］、鷹爪蝦Trachypenaeus curvirostris［27］、羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii［28］，因此，本試驗(yàn)中觀察到的染色體眾數(shù)僅占總數(shù)的63.46%，但仍在合理范圍內(nèi)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信。Ahmed［29］的核型穩(wěn)定性假說認(rèn)為，具有越多中部著絲點(diǎn)的染色體組成，一般有較為穩(wěn)定的染色體組型。口蝦蛄具有31對(duì)中部著絲粒染色體，占染色體總數(shù)約70.45%，遠(yuǎn)高于其他多染色體組型的水產(chǎn)種類，如匙吻鱘Polyodon spathula中部著絲粒染色體占染色體總數(shù)約36.67%［30］，泥鰍Misgurnus anguillicaudatus中部著絲粒染色體占染色體總數(shù)的16% ～25%［18］，它們皆具有不同倍性以及不穩(wěn)定的染色體組型，由此也間接證明，口蝦蛄也具有穩(wěn)定的染色體組型。此外，十足目中鎧甲蝦科Galatheidae和方蟹科Grapsidae中均發(fā)現(xiàn)了性染色體［31］，但由于口蝦蛄染色體數(shù)目較多，個(gè)體較小，因此，本研究中尚無法確定口蝦蛄是否存在性染色體。

一般來說，基因組大小 （DNA含量或C值）代表一個(gè)物種的遺傳信息，具有種的特征，同一生物個(gè)體各個(gè)組織的DNA含量是恒定的。但本研究中所檢測(cè)的口蝦蛄5種組織的DNA含量差異顯著。不同組織DNA含量的差異性不僅存在于口蝦蛄單一物種，也廣泛存在于其他水產(chǎn)動(dòng)物中［32］。本研究中評(píng)估到的口蝦蛄基因組大小平均約為9398.58 Mbp，遠(yuǎn)大于其他十足目種類，如棕蝦Penaeus aztecus基因組為2386.32 Mbp，凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei基因組為 3423.00 Mbp［33］。Koyama等［34］研究發(fā)現(xiàn)，包括日本對(duì)蝦在內(nèi)的十足目基因組普遍較大，且存在大量重復(fù)片段。本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄具有龐大的基因組，染色體中可能也存有大量的重復(fù)片段，這就可能造成細(xì)胞核DNA在復(fù)制過程中，出現(xiàn)擴(kuò)增、重組或流失現(xiàn)象［35］，導(dǎo)致不同組織的DNA含量存在顯著差異。此外，有報(bào)道表明，不同組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的特異性也是造成細(xì)胞核DNA含量差異的原因［36-37］。

截至目前，已報(bào)道的十足目動(dòng)物核型分析超過100種，但有關(guān)蝦蛄科種類的染色體組型尚未見報(bào)道。本研究中首次報(bào)道了十足目、蝦蛄科口蝦蛄的核型組成，為從親緣關(guān)系及物種進(jìn)化角度研究蝦蛄科在十足目中的系統(tǒng)分類地位提供了數(shù)據(jù)參考，也為口蝦蛄的細(xì)胞遺傳學(xué)和人工繁育研究提供了依據(jù)。同時(shí)，細(xì)胞核DNA含量的大小是生物特征參數(shù)之一，準(zhǔn)確獲得口蝦蛄細(xì)胞核DNA含量也為開展該物種染色體組工程組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)資料。

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Chromosome karyotype and nuclear DNA content of mantis shrimp Oratosquilla oratoria

LIU Hai-ying1，2，YANG Shuo1，2，YAN Hong-wei3，ZHOU He3，LIU Qi1，2，LIN Yuan4，LI Cheng-jiu4，GUO Liang-yong4

（1.Center for Marine Ranching Engineering Science Research of Liaoning，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；3.College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；4.Fisheries Seedlings Authority of Liaoning Province，Dalian 116015，China）

The karyotypic pattern was analyzed using colchicine injection method and DNA contents in different tissues were determined using DNA of the chicken blood cell as standard in mantis shrimp Oratosquilla oratoria by a flow cytometer to understand the karyotype，DNA content and genetics content.It was found that there were 88 chromosomes in diploid with 2n=88 in hepatopancreas specimen，with the karyotype formula of 2n=62m+12sm+ 14t，and total chromosome arm number（NF）of 162.The DNA content was significantly different in different tissues（P＜0.05），with the order as：muscle＞testicle＞ovary＞hepatopancreas＞blood，the maximal value（10.43 pg/2c）in muscle and the minimal（8.70 pg/2c）in blood，with an average of 9.61 pg/2c.Moreover，the average value of the mantis shrimp genome size was estimated to be 9398.58 Mbp as 1 pg=978 Mbp.The findings make a first step towards broodstock conservation and complete aquaculture of the mantis shrimp in the future.

Oratosquilla oratoria；chromosome；karyotype；DNA content

S917；Q953

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.001

2095-1388（2016）01-0001-06

2015-05-04

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目 （2014203016）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目 （2015-311）；農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目 （2014-MSENC-KF-14）；大連海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目 （2014017349）

劉海映 （1957—），男，教授。E-mail：hyliu@dlou.edu.cn

劉奇 （1983—），男，博士。E-mail：liuqisunson@dlou.edu.cn