非甾體類孕酮受體激動劑Tanaproget對兔動脈硬化的抑制作用及其機制

李莉,肖莉麗,李志芳,張彥周

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州450000)

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非甾體類孕酮受體激動劑Tanaproget對兔動脈硬化的抑制作用及其機制

李莉,肖莉麗,李志芳,張彥周

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州450000)

目的探討非甾體類孕酮受體激動劑Tanaproget對動脈硬化的影響及其可能的機制。方法 健康新西蘭大白兔24只隨機分為正常飼料(干草粉)喂養(yǎng)組(正常組)、高脂飼料(2%膽固醇+1%豬油+90%普通飼料)喂養(yǎng)組(模型組)、高脂飼料加Tanaproget喂養(yǎng)組(干預(yù)組)，模型組及干預(yù)組于喂養(yǎng)第1周末，耳緣靜脈注射牛血清白蛋白250 mg/kg。實驗1周末和10周末，檢測血清甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，ELISA法檢測血清白細(xì)胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)；實驗10周末隨機抽取每組中一只取主動脈做油紅O染色，其余取主動脈弓做石蠟包埋切片并行HE染色，提取血管組織蛋白，采用Western blotting法檢測核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)和Toll樣受體4(TLR4)。結(jié)果實驗10周末模型組和干預(yù)組血清 TG、LDL-C水平較正常組升高(P均<0．01)；實驗后模型組血清IL-8、TNF-α水平較正常組和干預(yù)組升高(P均<0．01)；大體標(biāo)本油紅O染色肉眼可見模型組斑塊明顯多于、大于正常組和干預(yù)組；HE染色后模型組主動脈內(nèi)膜厚度明顯大于正常組和干預(yù)組。模型組NF-κB、TLR4表達(dá)明顯高于正常組和干預(yù)組(P均<0．01)。結(jié)論 Tanaproget通過特異性與孕酮受體結(jié)合后調(diào)節(jié)血脂代謝，同時抑制活化的TLR4/NF-κB信號通路，減少炎癥因子的轉(zhuǎn)錄與生成，從而發(fā)揮其抗動脈硬化作用。

動脈硬化;孕酮受體激動劑；血脂;核轉(zhuǎn)錄因子κB; Toll樣受體4;白細(xì)胞介素8;腫瘤壞死因子α;新西蘭大白兔

冠心病發(fā)生率逐年上升，發(fā)病人群也逐漸從中老年人群向中青年人群發(fā)展，且有一定程度的致殘率及致死率，嚴(yán)重威脅人類健康，動脈硬化(AS)是這種疾病發(fā)生發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié)。研究顯示，絕經(jīng)前女性冠心病發(fā)病率明顯低于絕經(jīng)后女性及同齡男性，其原因與女性雌孕激素有關(guān)。孕酮受體激動劑對AS的抑制作用在國內(nèi)外已有部分研究。Tanaproget(TNPR)是一種非甾體類孕酮受體激動劑，可特異性與孕酮受體結(jié)合，減少了一些非特異性結(jié)合帶來的不良作用，如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌的發(fā)生。2015年6～9月，我們通過建立AS動物模型，探討了TNPR對AS的影響及其可能的機制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料動物：健康雄性新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量2.3～2.7 kg，3～4月齡，來自河南省動物實驗中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進入實驗。試劑及儀器：普通飼料由河南省動物實驗中心提供，其余均購自南京奧多福尼生物科技有限公司，TNPR(上海交通大學(xué)提供)，ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，Toll樣受體4(TLR4)、β-actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2動物分組和模型建立健康雄性新西蘭大白兔24只隨機分為正常組8只、模型組8只、干預(yù)組8只。正常組普通飼料(干草粉)喂養(yǎng)。模型組喂養(yǎng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%膽固醇+10%豬油+90%普通飼料，干預(yù)組喂養(yǎng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%膽固醇+10%豬油+90%普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)開始1周后給予TNPR干預(yù)，按10 mg/kg體質(zhì)量灌胃，模型組及干預(yù)組在喂養(yǎng)飼料的基礎(chǔ)上，于喂養(yǎng)第1周末，耳緣靜脈一次性注射250 mg/kg的牛血清白蛋白，1次/周,連續(xù)注射四周[1]，均自由飲水，10周后進行血脂測定，隨機各組挑選一只行主動脈油紅O染色有大量粥樣硬化斑塊形成確定AS模型建造成功。10周后，氣體栓塞處死，分離主動脈，10%甲醛浸泡24 h后油紅O染色,肉眼觀察動脈斑塊。主動脈內(nèi)膜增厚或出現(xiàn)斑塊為模型成功。

1.3主動脈、肝臟組織形態(tài)的觀察兔飼養(yǎng)10周末取材，氣體栓塞處死，分離主動脈，生理鹽水沖凈，分為主動脈根部、主動脈弓至胸主動脈、腹主動脈3段，再取部分肝臟組織置入體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋與石蠟切片處理后，一部分行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察，另一部分冰箱保存待檢。

1.4血脂的檢測分別于實驗開始、飼養(yǎng)10周末采血。于清晨空腹(空腹大于12 h)從兔耳中動脈采集血液2 mL。注入不含抗凝劑的普通試管。全自動生化儀測定TG、LDL-C。

1.5血清IL-8、TNF-α的檢測采血時間及要求同上。注入含抗凝劑的普通試管，自動離心機離心取上清，采用ELISA法分別檢測血清中的IL-8、TNF-α水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。每種因子均采用雙份檢測。檢測后應(yīng)用酶標(biāo)儀測定吸光值(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算相關(guān)數(shù)值。

1.6主動脈弓部TLR4、NF-κB的檢測用Western blotting法。取-80 ℃冰箱冷凍保存組織，按0.1 g/50 μL比例加RIPA裂解液混勻，冰上裂解30 min,置于4 ℃恒溫離心機12 000 g/min離心25 min，吸取上清于EP管中，用微孔酶標(biāo)儀法(CBA試劑盒)測定蛋白濃度，計算上樣量恒定為10 mg的蛋白溶液體積。制好膠(10%的分離膠，5%的積層膠)后上樣80 V電泳70 min，200 mA轉(zhuǎn)膜蛋白至PVDF膜上后，用30%的脫脂奶粉封閉2 h，1×TBST洗凈，一抗孵育(4 ℃過夜，一抗工作濃度β-actin 1∶3 000,TLR4 1∶800,NF-κB 1∶800)，1 × TBST洗凈，二抗孵育(1∶1 000)2 h，1 × TBST洗凈后ECL顯色曝光。采用Alphariew軟件對進行灰度值分析，以目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2　結(jié)果

2．1三組形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果正常組無斑塊。模型組血管可見多處斑塊，干預(yù)組可見多處斑塊，但斑塊少于并小于模型組。HE染色示正常組主動脈內(nèi)膜光滑，中膜結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)彈力板結(jié)構(gòu)正常。模型組主動脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)彈力板結(jié)構(gòu)破壞，有斑塊突向管腔，斑塊內(nèi)壞死物質(zhì)未染色。干預(yù)組可見內(nèi)膜增厚，厚度小于模型組。

2．2三組不同時間血清TG、LDL-C、IL-8、TNF-α水平比較第1周末各組新西蘭大白兔血清TG、LDL-C、IL-8、TNF-α水平組間、組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第10周末組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，組間有統(tǒng)計學(xué)差異，見表1。

表1　各組不同時間血清TG、LDL-C、IL-8、TNF-α水平比較

注：與正常組同時間比較，*P<0.01;與模型組同時間比較，#P<0.01。

2.3三組主動脈弓部TLR4、NF-κB相對表達(dá)量比較模型組TLR4、NF-κB表達(dá)高于正常組和干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1,表2)。

圖1　各組NF-κB、TLR4表達(dá)的電泳圖

組別nNF-κB/β-actinTLR4/β-actin正常組80.52±0.310.68±0.28模型組81.09±0.21*#1.32±0.18*#干預(yù)組80.76±0.420.94±0.32

注：與正常組比較，*P<0.01；與干預(yù)組比較，#P<0.01。

3　討論

AS與脂質(zhì)代謝障礙有關(guān)，TG升高會導(dǎo)致動脈內(nèi)膜損傷，并且在內(nèi)膜下形成堆積，從而影響血液黏稠度。當(dāng)血中TG升高時，肝臟合成LDL-C增強，同時HDL-C水平降低，進而加速了AS的形成和發(fā)展[2]。本研究中，TNPR干預(yù)后TG、LDL-C水平明顯降低，即 TNPR可以通過調(diào)節(jié)血脂代謝、降低血脂水平，抑制血管內(nèi)膜受損而達(dá)到抑制AS進展的目的，但其具體如何調(diào)節(jié)血脂代謝的分子機制有待進一步研究。

在AS發(fā)生、發(fā)展中炎癥具有重要的病理作用，而炎癥是機體對于各種外源性或內(nèi)源性損傷因子引起的組織或細(xì)胞損傷所產(chǎn)生的機體防御性反應(yīng)，發(fā)生機制非常復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞因子，如TNF-α、黏附因子、細(xì)胞因子、趨化因子等介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路都參與了機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展過程。有研究顯示，TNPR對體內(nèi)炎癥反應(yīng)中的炎癥因子有明顯干預(yù)抑制作用[3]。

Toll樣受體(TLR)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。人類TLR家族成員已確認(rèn)的有10個，他們分布于不同細(xì)胞表面，其中TLR4主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞表面。TLR4的結(jié)構(gòu)分為3個區(qū)域：胞外域、跨膜域、胞內(nèi)域。胞外域是一段重復(fù)的亮氨酸序列，可與CD13結(jié)合，介導(dǎo)病原相關(guān)分子模式的識別。胞內(nèi)域是一段高度保守的序列，該序列與IL-1受體胞內(nèi)區(qū)具有同源性，故又稱為TIR區(qū)域,當(dāng)TLR4與相應(yīng)配體結(jié)合后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至TIR區(qū)域，然后進一步激活NF-κB信號通路[4]。NF-κB是一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，作為早期轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB的激活不需要新翻譯出的蛋白進行調(diào)控，使其可在第一時間對有害細(xì)胞的NF-κB信號通路刺激做出反應(yīng)。參與免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子都受NF-κB的調(diào)控，包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12等。

炎癥啟動首先是炎癥細(xì)胞的激活。內(nèi)皮細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞可由各種物理、化學(xué)等因素刺激激活，激活后的炎細(xì)胞能產(chǎn)生多種促炎因子和趨化因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8以及活性氧[5]。TLR4作為一種內(nèi)源性配體，廣泛分布于單核巨噬細(xì)胞表面，非特異性TLR4激動劑激活TLR4，通過其下級信號通路激活I(lǐng) κB激酶,并進一步磷酸化NF-κB抑制性亞基(IκB)。激活的NF-κB與IκB解離后轉(zhuǎn)位入核與多種靶基因啟動子/增強子上的κB序列結(jié)合，從而誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α等)的表達(dá)[6]。TNF-α作為一種炎癥因子刺激、損傷血管內(nèi)膜細(xì)胞，趨化白細(xì)胞，吸附血管平滑肌細(xì)胞遷移并促其增殖，使血管腔狹窄，是形成AS的重要環(huán)節(jié)。TNF-α在炎癥反應(yīng)中的主要作用為通過增加中性粒細(xì)胞CD18表面抗原來增強其對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及抗體依賴性細(xì)胞毒反應(yīng)，也能增加血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸的合成與釋放；可促進內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和IL-8、PAF的釋放，使中性粒細(xì)胞游走與激活。TNF-α能促進間質(zhì)性膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)[7]，降解大分子間質(zhì)膠原和基質(zhì)金屬蛋白，同時增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解，利于細(xì)胞遷移和增殖[8]，增加斑塊不穩(wěn)定性。本研究結(jié)果顯示，模型組在干預(yù)10周后，TNF-α、IL-8、TLR4、NF-κB均升高，而干預(yù)組各個指標(biāo)均降低，且明顯低于模型組。提示TNPR通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，抑制 TNF-α、IL-8的基因激活及蛋白的轉(zhuǎn)錄，進而影響炎細(xì)胞的激活、活化，反過來再次干擾TLR4/NF-κB信號通路，最終減輕了機體的炎癥反應(yīng)、延緩AS的發(fā)展。

綜上認(rèn)為，TNPR通過特異性與孕酮受體[9]結(jié)合后調(diào)節(jié)了血脂代謝，同時抑制活化TLR4/NF-κB信號通路，減少炎癥因子的轉(zhuǎn)錄與生成，降低炎癥損傷、細(xì)胞外基質(zhì)降解，減弱吸附、趨化白細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，延緩了AS的發(fā)生、發(fā)展，這其中涉及到信號通路的一些具體調(diào)節(jié)方式及方法有待進一步探討。

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張彥周(E-mail:zhangyanzhou2050@sina.com)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.011

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1002-266X(2016)17-0034-03

2015-11-15)