EGFL7在鼻咽癌組織中的表達(dá)研究

趙燕戀，楊繼紅，盧永田，張　娟，苗芳芳，李潔萍（.深圳大學(xué)附屬羅湖醫(yī)院，廣東深圳58000；.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東58000）

EGFL7在鼻咽癌組織中的表達(dá)研究

趙燕戀1，楊繼紅1，盧永田2，張娟1，苗芳芳1，李潔萍1
（1.深圳大學(xué)附屬羅湖醫(yī)院，廣東深圳518000；2.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東518000）

目的觀察表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域7（EGFL7）在鼻咽癌中的表達(dá)，探討其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)2010年7月至2013年7月該院40例鼻咽癌患者蠟塊標(biāo)本（研究組）及20例鼻咽炎患者炎癥組織（對(duì)照組）中EGFL7的表達(dá)；采用CD31抗體標(biāo)記通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)研究組及對(duì)照組的微血管密度（MVD），并分析EGFL7的表達(dá)與腫瘤臨床分期及MVD的相關(guān)性。結(jié)果兩組EGFL7陽(yáng)性表達(dá)率均很高（研究組為92.5%，對(duì)照組為85.0%），但二者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），研究組中EGFL7高表達(dá)率（37.9%）高于對(duì)照組（10.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；研究組中EGFL7的表達(dá)與患者性別、年齡、EB病毒抗體無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）；與EGFL17表達(dá)高低、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，EGFL7表達(dá)與MVD值呈正相關(guān)（r=0.700，P=0.000）。結(jié)論EGFL7在鼻咽癌細(xì)胞中有表達(dá)，并與鼻咽癌的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；其可能通過(guò)影響血管的生成參與鼻咽癌的發(fā)展，有可能成為反映鼻咽癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的標(biāo)志物之一。

鼻咽腫瘤；表皮生長(zhǎng)因子；結(jié)構(gòu)域；毛細(xì)血管；腫瘤轉(zhuǎn)移

表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域7（EGFL7）是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性分泌因子，參與血管管腔的形成，腫瘤中有大量的新生血管，因此阻斷新生血管EGFL7的表達(dá)可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［1］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7除限定于血管內(nèi)皮系統(tǒng)外，在一些腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)。如上皮來(lái)源的腎癌［2］、喉癌［3-4］、胃癌［5］、乳腺癌［6］、肺癌［7］、肝癌［8］，以及間葉來(lái)源的人腦膠質(zhì)瘤［9］等已有相關(guān)報(bào)道，但在鼻咽癌中是否表達(dá)鮮有相關(guān)報(bào)道。鼻咽癌是我國(guó)南方常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，病因與種族易感性、遺傳因素及EB病毒感染等有關(guān)，是較為特殊的上皮源性惡性腫瘤，也是黏膜上皮在鱗狀上皮化生的基礎(chǔ)上癌變形成的，含有豐富的淋巴組織，具有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。但迄今為止，鼻咽癌缺乏敏感性、特異性高的標(biāo)志物。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法檢測(cè)鼻咽癌（研究組）與鼻咽炎（對(duì)照組）組織中EGFL7的表達(dá)，采用CD31抗體進(jìn)行免疫組化檢測(cè)研究組及對(duì)照組的微血管密度（MVD），探討EGFL7在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料收集本院2010年7月至2013年6月40例鼻咽癌患者的蠟塊標(biāo)本作為研究組，以同期20例鼻咽炎患者炎癥組織作為對(duì)照組。研究組患者中男33例，女7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。依據(jù)鼻咽癌2008分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ、Ⅱ期32例，Ⅲ、Ⅳ期8例。對(duì)照組患者鼻咽炎包括以慢性炎癥為主的慢性鼻咽炎及以腺體、淋巴增生為主的腺樣體肥大。

1.2試劑及方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器兔抗人EGFL7單克隆抗體、鼠抗人CD31單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體、抗體稀釋液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DAB濃縮加強(qiáng)型試劑盒（廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司），組織切片機(jī)（Leica公司），顯微鏡（OLYMPUS公司），染色劑（SAKURA公司）。

1.2.2方法

1.2.2．1CD31、EGFL7免疫組化法檢測(cè)具體步驟：所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。切片后放入65℃烤箱2 h，二甲苯3缸，每缸10 min，脫蠟；梯度乙醇水化，蒸餾水洗3 min，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)3 min，自然冷卻至室溫；3%過(guò)氧化氫溶液抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：室溫放置10 min；以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4）沖洗2min，共5次；Anti-CD31抗原、Anti-EGFL7抗原分別用抗體稀釋液以1∶100稀釋，均于4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗2 min，共5次，山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體于37℃孵育30 min；PBS沖洗2 min，共5次；DAB顯色3 min；蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸乙醇分化5 s，蒸餾水返藍(lán)1 min。梯度乙醇脫水﹑二甲苯透明﹑中性樹(shù)膠封片。

1.2.2.2判斷標(biāo)準(zhǔn)EGF7為細(xì)胞質(zhì)染色，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Shimizu方法。（1）染色程度：細(xì)胞質(zhì)無(wú)顯色為0分；細(xì)胞質(zhì)呈云霧狀淡黃色為1分；細(xì)胞質(zhì)呈黃色顆粒狀為2分；細(xì)胞質(zhì)均勻深黃色為3分；（2）陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于或等于10%為0分；＞10%～40%為1分；＞40%～70%為2分；＞70%為3分。（3）總積分為著色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分之和；（4）總積分0分為（-），1～2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。（5）總積分大于或等于3分為高表達(dá)，＜3分為低表達(dá)。根據(jù)Vimtemin結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞質(zhì)染色出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中染色陽(yáng)性的細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞小于或等于10%為陰性，＞10%為陽(yáng)性。

1.2.2.3MVD測(cè)定MVD計(jì)數(shù)：在200倍鏡下隨機(jī)記錄5個(gè)視野血管數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1兩組EGFL7表達(dá)情況研究組陽(yáng)性表達(dá)37例（92.5%），對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)17例（85.0%），兩組EGFL7陽(yáng)性表達(dá)率均較高，但二者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.208，P＞0.05）。研究組高表達(dá)25例（62.5%），對(duì)照組中高表達(dá)2例（10.0%），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.966，P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

2.2兩組MVD表達(dá)情況研究組MVD均值為（67.008± 22.122），對(duì)照組為（71.420±16.187），兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.791，P＞0.05）。但研究組中EGFL7高表達(dá)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期高（Ⅲ期）的標(biāo)本中MVD值較低表達(dá)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期低（Ⅰ～Ⅱ期）標(biāo)本高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究組中各組MVD情況見(jiàn)表2，圖2、3。

圖1　EGFL7在鼻咽癌及鼻咽炎中的表達(dá)（200×）

表1　EGFL7與研究組鼻咽癌組織臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

表2　研究組中MVD與EGFL7、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期的相關(guān)性±s）

表2　研究組中MVD與EGFL7、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期的相關(guān)性±s）

M V D分組n t P E G F L 7低表達(dá)E G F L 7高表達(dá)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移T N M分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ2 5 1 5 1 6 2 4 5 5 . 0 8 8 ± 1 7 . 2 7 5 8 6 . 8 7 3 ± 1 3 . 2 3 7 8 1 . 2 1 9 ± 2 0 . 9 6 5 5 7 . 5 3 3 ± 1 7 . 5 8 0 -6 . 1 1 8 0 . 0 0 0 -3 . 8 6 5 0 . 0 0 0 3 2 8 6 2 . 6 5 3 ± 2 2 . 1 9 6 8 4 . 4 2 5 ± 1 0 . 5 5 5 -2 . 6 8 0 0 . 0 1 1

圖2　研究組EFGL7高、低表達(dá)組中CD31標(biāo)記的MVD結(jié)果（200×）

圖3　研究組有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中CD31標(biāo)記的MVD結(jié)果（200×）

2.3研究組鼻咽癌組織中MVD與EGFL7表達(dá)的相關(guān)性分析經(jīng)Pearson分析發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中MVD值與EGFL7的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.700，P=0.000）。見(jiàn)圖4。

圖4　研究組鼻咽癌組織中MVD與EGFL7表達(dá)的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3　討　論

以往研究大多以腫瘤與正常組織進(jìn)行對(duì)比，但鑒于倫理問(wèn)題，不可能取正常組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，即便是癌旁組織，其血供也相當(dāng)豐富。本研究以鼻咽癌患者標(biāo)本為研究組，以同期鼻咽炎患者炎癥組織作為對(duì)照組。過(guò)去研究認(rèn)為，EGFL7的表達(dá)僅限于血管內(nèi)皮系統(tǒng)，但目前部分研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤細(xì)胞也可表達(dá)EGFL7。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，EGFL7在鼻咽癌細(xì)胞中及炎癥組織中陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其原因可能是鼻咽部位特殊，本身富含血管及淋巴管，鼻咽炎中血管豐富，而EGFL7在血管內(nèi)皮有較強(qiáng)的表達(dá)，所以鼻咽炎組織中EGFL7的陽(yáng)性表達(dá)高。但鼻咽癌組織中的EGFL7高表達(dá)率要高于鼻咽炎組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明不僅血管內(nèi)皮系統(tǒng)有EGFL7，鼻咽癌細(xì)胞中也有表達(dá)EGFL7的可能。本研究結(jié)果顯示，在鼻咽癌細(xì)胞質(zhì)中有EGFL7的表達(dá)正好詮釋這點(diǎn)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，研究組中EGFL7表達(dá)水平與MVD呈正相關(guān)（r=0.700，P=0.000），且鼻咽癌組織中EGFL7的表達(dá)還與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。作者推測(cè)，EGFL7可能通過(guò)影響血管的生成參與鼻咽癌的發(fā)展。鼻咽癌的侵襲生長(zhǎng)高度依賴于新生血管，其可以從中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)鼻咽癌周圍的血管改變構(gòu)成了一個(gè)有利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與侵襲，鼻咽癌的侵襲、轉(zhuǎn)移與血管新生是相互作用、相互依存的［10-11］。EGFL7在鼻咽癌中的作用機(jī)制可能是腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)分泌的EGFL7蛋白易化腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲入血流中；同時(shí)微血管內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)EGFL7蛋白，并且從血流中捕獲腫瘤細(xì)胞，易化腫瘤細(xì)胞以血管外滲方式進(jìn)入新的組織器官［1，12］。隨著鼻咽癌臨床及病理級(jí)別的增加，其血管新生的活躍程度也增加，EGFL7的表達(dá)也隨著腫瘤浸潤(rùn)程度加深而增加［13］。

綜上所述，EGFL7的表達(dá)與鼻咽癌及其浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，EGFL7可能成為反映鼻咽癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的標(biāo)志物之一，但要作為鼻咽癌的特異性抗體有待于進(jìn)一步考證。鼻咽癌的侵襲、轉(zhuǎn)移除了血行轉(zhuǎn)移外，還可通過(guò)淋巴途徑，尤其對(duì)于鼻咽癌，淋巴轉(zhuǎn)移尤為重要；而且鼻咽癌是較為特殊的上皮源性惡性腫瘤，不僅血管豐富，其上皮下是更為豐富的淋巴組織，具有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答［14-15］。那么EGFL7在淋巴內(nèi)皮中是否也有表達(dá)，EGFL7是否對(duì)血管、淋巴管具有雙重作用，也可能成為新的研究亮點(diǎn)。

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Study on expression of EGFL7 in nasopharyngeal carcinoma tissue

Zhao Yanlian1，Yang Jihong1，Lu Yongtian2，ZhangJuan1，Miao Fangfang1，Li Jieping1（1.Affiliated Luohu Hospital of Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518000，China；2.Shenzhen Municipal Second People′s Hospital，Shenzhen，Guangdong 518000，China）

ObjectiveTo observe the epidermal growth factor structure domain 7（EGFL7）expression in nasopharyngeal carcinoma（NPC），and to explore its clinical significance.MethodsThe immunohistochemical method was used to detect the EGFL7 expression in 40 NPC tissue paraffin samples（study group）and 20 nasopharyngitis tissue samples（control group）in our hospital from July 2010 to July 2013；the CD31 antibody labeling immunohistochemical method was adopted to detect the microvas cular density（MVD）in the study group and control group，then the correlation between the EGFL7 expression with tumor clinical stage and MVD was analyzed.ResultsThe EGFL7 positive expression rate in the two groups was higher（92.5%for the study group and 85.0%for the control group），but there was no statistically significant difference between them（P＞0.05）.The EGFL7 high expression rate in the study group was higher than that in the control group，the difference was statistically significant（37.9% vs.10.0%，P＜0.05）；the EGFL7 expression in the study group had no correlation with the patients′gender，age and EB viral anti body（P＞0.05）；and had correlation with the high and low expression of EGFL7，lymph node metastasis and clinical stage（P＜0.05）. The Pearson correlation analysis found the positive correlation between EGFL7 expression and MVD value（r=0.700，P=0.000）. ConclusionEGFL7 is expressed in NPC cells，moreover is closely associated with the growth，invasion and metastasis of NPC，which may participate in the development of NPC by affecting the blood vessels generation and may become one of markers reflecting NPC metastasis and prognosis.

Nasopharyngeal neoplasms；Epidermal growth factor；Domains；Capillaries；Neoplasm metastasis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.007

A

1009-5519（2016）04-0497-03

趙燕戀（1980-），碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事鼻咽癌基礎(chǔ)與臨床研究。

（2015-11-21）