CTGF siRNA對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響

丁　爽，方　芳，段宏梅，肖衛(wèi)國

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽110001）

CTGF siRNA對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響

丁爽，方芳，段宏梅，肖衛(wèi)國

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽110001）

目的小干擾RNA技術(shù)沉默結(jié)締組織生長因子（CTGF）表達(dá)，并觀察對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）凋亡及對部分凋亡相關(guān)基因的影響。方法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CTGF siRNA至FLS，real time PCR篩選出有效的CTGF siRNA。使FLS CTGF表達(dá)沉默后，采用FITC-PI雙染法通過流式細(xì)胞儀檢測對FLS凋亡的影響。Real-time PCR檢測CTGF基因沉默對bax、bclxl和survivin等凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果篩選出H-1序列是針對人CTGF的特異性SiRNA，抑制率＞70%。在外源性CTGF作用下，由去血清導(dǎo)致的FLS凋亡明顯減少；沉默F(xiàn)LS中的CTGF基因表達(dá)，F(xiàn)LS的凋亡明顯增加。在FLS中CTGF基因表達(dá)沉默后，Bax基因表達(dá)上調(diào)，bcl-xl基因表達(dá)下調(diào)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。survivin基因表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論CTGF減少RA FLS凋亡的保護(hù)性作用很可能是通過維持survivin表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

結(jié)締組織生長因子；成纖維樣滑膜細(xì)胞；凋亡

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類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要累及外周關(guān)節(jié)的常見自身免疫性疾病，滑膜的慢性炎癥是其主要病變之一。有研究表明成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）的增殖與凋亡失衡在RA的滑膜病變中發(fā)揮主要作用［1］。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是一種富含半胱氨酸的生長調(diào)節(jié)因子，病理狀態(tài)下的過度表達(dá)與多種增生性或纖維化性疾病相關(guān)，最近有研究［2］顯示它可能參與RA的發(fā)生和發(fā)展。RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）是一種轉(zhuǎn)錄后沉默基因的強(qiáng)大工具，小干擾RNA（small interfered RNA，siRNA）可以用來研究在各種組織中基因產(chǎn)物的功能［3］。CTGF在RA疾病中的研究已經(jīng)取得了初步進(jìn)展［4］，拮抗CTGF活性的研究成為防治RA所致滑膜細(xì)胞增殖的新策略。

本實(shí)驗(yàn)篩選出在FLS干擾效果達(dá)70%以上的siCTGF，通過流式細(xì)胞儀檢測CTGF siRNA干擾對體外培養(yǎng)的FLS凋亡的影響，real-time PCR方法檢測bax、bcl-xl、survivin等凋亡相關(guān)基因表達(dá)，分析應(yīng)用小干擾RNA對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜病變的干預(yù)作用，進(jìn)一步探討CTGF在RA發(fā)病中可能作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本及試劑

滑膜組織取材于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科行關(guān)節(jié)鏡滑膜切除術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)的3例RA患者，所有標(biāo)本取得均獲得患者知情同意。患者診斷均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）修訂的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。試劑主要包括：重組人CTGF（rhCTGF，Biovender Laboratory Medicine公司）、Lipofecamine2000（美國Invitrogen Life Technologies公司）、Annexin V-FITC試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）、熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物公司）、Trizol Reagent（美國Invitrogen Life Technologies公司）

1.2方法

1.2.1RA FLS的培養(yǎng)和鑒別：磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗滑膜組織，反復(fù)剪切成約1 mm×1 mm×1 mm的細(xì)小組織塊，加入膠原酶Ⅰ（1 mg/mL）37℃消化2 h，70 μm尼龍網(wǎng)過濾收集細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長成梭形并80%融合成片后傳代。免疫組化法鑒定，99%的第3代細(xì)胞抗Vimentin抗體陽性同時(shí)抗CD68抗體陰性，鑒定為FLS。實(shí)驗(yàn)用第3～7代細(xì)胞。

1.2.2CTGF siRNA干擾試驗(yàn)：根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司人工合成3對隨機(jī)siRNA。轉(zhuǎn)染前1 d將FLS以2×105/孔鋪于24孔板，使轉(zhuǎn)染時(shí)密度能夠達(dá)到80%。分別加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000與對照SiRNA（SiNC）和CTGF特異性SiRNA（SiCTGF）的復(fù)合物，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后更換為正常含血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h通過熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染至24 h后，加Trizol，收集細(xì)胞，real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效率及凋亡相關(guān)基因（bax、bcl-xl、survivin）的表達(dá)。

1.2.3Annexin V-FITC和PI雙染檢測FLS凋亡：轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞鋪板于6孔板中使轉(zhuǎn)染時(shí)密度能夠達(dá)到80%。分別加入無血清培養(yǎng)基，25 ng/mL的rhCTGF、siNC和siCTGF，轉(zhuǎn)染步驟同1.2.2。24 h后收集細(xì)胞，加入Annexin V-FITC和碘化丙錠溶液上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.2.4Real-time PCR檢測CTGF和部分凋亡相關(guān)基因的表達(dá)：根據(jù)人CTGF基因的基因序列（Gen bank登錄號：NM_001901），按Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，見表1。收集FLS細(xì)胞，加Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將熒光染料SYBR和目的基因與內(nèi)參18 S的引物混勻后，加入real-time PCR檢測板密封上機(jī)檢測（ABI7500）。反應(yīng)條件：95℃30 s 1個(gè)循環(huán)，95℃5 s 60℃34 s 40個(gè)循環(huán)，95℃15 s 60℃1 min 95℃15 s 1個(gè)循環(huán)。根據(jù)PCR反應(yīng)信號強(qiáng)度Ct值計(jì)算每個(gè)樣本的基因相對表達(dá)量。

表1　Real-time PCR檢測基因及引物序列Tab.1 Gene and primer sequence for real-time PCR

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad prism 5.0進(jìn)行作圖和分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CTGF siRNA篩選

我們分別設(shè)計(jì)了3條針對人CTGF基因的雙鏈小RNA（siRNA），同時(shí)用與哺乳動物無關(guān)的siRNA作為陰性對照（siRNA of negative control，siNC）。用脂質(zhì)體（Lipofectamine2000）將siRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，熒光顯微鏡觀察表明轉(zhuǎn)染成功，見圖1。Realtime PCR檢測干擾24 h后CTGF的表達(dá)水平，H-1、H-2、H-3抑制率分別為77%、44%和2%，其中H-1是針對人CTGF的特異性siRNA，抑制率＞70%，因此，選用這一siRNA進(jìn)行FLS凋亡實(shí)驗(yàn)。

2.2CTGF對FLS凋亡的影響

向培養(yǎng)的饑餓的FLS中加入外源性的CTGF，用V-FITC和PI雙染的方法通過流式細(xì)胞儀檢測FLS的凋亡。在外源性的CTGF作用下，由去血清導(dǎo)致的FLS凋亡明顯減少。沉默F(xiàn)LS中的CTGF基因表達(dá)，F(xiàn)LS的凋亡明顯增加，見圖2。

2.3CTGF siRNA對凋亡調(diào)控因子表達(dá)的影響

圖1　熒光顯微鏡下觀察CTGF siRNA轉(zhuǎn)染×100Fig.1 Transfection of CTGF siRNA under fluorescence microscope×100

CTGF基因沉默后，real-time PCR檢測結(jié)果顯示：bax、bcl-xl和survivin基因相對表達(dá)量分別為1.28±0.08，0.59±0.07和0.36±0.07。bax基因表達(dá)上調(diào)，bcl-xl基因表達(dá)下調(diào)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。survivin基因表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，CTGF很可能是通過增加survivin基因的表達(dá)產(chǎn)生對FLS的正向調(diào)節(jié)作用。

3　討論

圖2　外源性CTGF、siCTGF對FLS凋亡的影響Fig.2 Effects of rhCTGF/siCTGF on FLS apoptosis

RNA干擾（RNAi）是由長21～23個(gè)堿基對的雙鏈RNA介導(dǎo)，通過堿基互補(bǔ)配對，導(dǎo)致序列特異的基因沉默。目前，已被廣泛應(yīng)用于探索基因功能、防治病毒感染以及治療腫瘤等。siRNA安全高效，是近年應(yīng)用最為廣泛的特異性基因功能研究方法。本研究發(fā)現(xiàn)在外源性的CTGF作用下由去血清作用導(dǎo)致的FLS凋亡明顯減少。隨后針對CTGF mRNA 3個(gè)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)了3組siRNA，通過干擾后CTGF表達(dá)變化篩選出干擾效率最高的CTGF特異性siRNA，用這一siRNA轉(zhuǎn)染FLS，沉默F(xiàn)LS中CTGF基因表達(dá)，F(xiàn)LS凋亡增加，提示CTGF可能參與了FLS凋亡減少。

在RA發(fā)病機(jī)制中，F(xiàn)LS增殖的增加和（或）凋亡的減少均導(dǎo)致滑膜增生。survivin作為凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成員之一，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，也是目前分子量最小的IAP蛋白。近年來多項(xiàng)研究［5～7］表明survivin參與RA的發(fā)病。Svensson等［5］研究發(fā)現(xiàn)早期RA患者血清中survivin的表達(dá)對患者關(guān)節(jié)侵蝕度和治療的效果有一定的預(yù)測性。Bokarewalz等［6］研究發(fā)現(xiàn)有關(guān)節(jié)破壞的RA患者關(guān)節(jié)滑液中survivin水平顯著高于沒有關(guān)節(jié)破壞的患者，同時(shí)改變病情抗風(fēng)濕藥可降低RA患者關(guān)節(jié)滑液中survivin水平。Ahn等［7］研究發(fā)現(xiàn)survivin蛋白在RA滑膜細(xì)胞中高表達(dá)與關(guān)節(jié)破壞程度呈明顯的正相關(guān)。本研究結(jié)果證明通過siRNA使CTGF表達(dá)沉默后，會使由去血清導(dǎo)致的FLS凋亡明顯增加，同時(shí)survivin mRNA表達(dá)明顯減低。因此認(rèn)為CTGF阻止RA FLS的凋亡，這種保護(hù)性作用很可能是通過維持survivin的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

有關(guān)CTGF與細(xì)胞凋亡的關(guān)系在不同研究中還存在爭議。在有些研究中，CTGF發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，比如近來有國內(nèi)學(xué)者［8］研究發(fā)現(xiàn)外源性重組CTGF能夠促進(jìn)腎小管細(xì)胞的凋亡，同時(shí)CTGF siRNA減少腎小管細(xì)胞的凋亡；而在另一些研究中CTGF又發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，有學(xué)者［9］發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者過表達(dá)CTGF會對順鉑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抵抗增加。本研究發(fā)現(xiàn)抑制CTGF活性可顯著增加FLS細(xì)胞凋亡，提示CTGF在RA滑膜病變過程中可能發(fā)揮抑制FLS凋亡的作用，而FLS細(xì)胞凋亡功能降低導(dǎo)致細(xì)胞過度增生和活化也是RA滑膜病變形成和發(fā)展的重要原因之一。

然而，CTGF是一種具有多效性的基質(zhì)蛋白，在不同類型的細(xì)胞中及不同的環(huán)境因素下CTGF的生物學(xué)功效可能截然不同，CTGF的多效性也決定了它可能在炎癥過程的不同階段通過多種途徑影響炎癥的多種環(huán)節(jié)來起作用。因此，關(guān)于CTGF參與RA發(fā)病過程的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)及揭示。

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（編輯武玉欣）

Effect of CTGF siRNA on Apoptosis of Fibroblast-like Synoviocytes of Rheumatoid Arthritis

DING Shuang，F(xiàn)ANG Fang，DUAN Hongmei，XIAO Weiguo
（Department of Rheumatology and Immunology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To silence the expression of CTGF by small interfering RNA technology，to observe the influence on fibroblast-like synovial cell apoptosis and several apoptosis-related genes，and to explore the mechanism of action of CTGF in rheumatoid arthritis synovial lesions.Methods Effective CTGF siRNA was screened through real-time PCR.The influence of CTGF siRNA on FLS apoptosis was detected with FITC-PI double staining by flow cytometry.bax，bcl-xl and survivin were detected using real-time PCR when CTGF mRNA has been silenced.Results Compared with other 2 groups of oligo and NC oligo，H1 oligo exhibited the strongest interfering action to CTGF（inhibition ratio＞70%），so that it is selected as the effective target gene sequence for the following experiment.Apoptosis of FLS induced by serum deprivation was significantly decreased in the presence of exogenous CTGF.When expression of the CTGF gene was knocked down in FLS，F(xiàn)LS apoptosis was significantly increased，and expression levels of survivin mRNA were decreased significantly（P＜0.01）.Conclusion FLS survival is positively regulated by CTGF，which may through the sustaining the expression of survivin.

connective tissue growth factor；fibroblast-like synoviocytes；apoptosis

R593.22

A

0258-4646（2016）05-0430-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.012

遼寧省醫(yī)學(xué)高峰建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（2010006）

丁爽（1981-），女，講師，博士.

肖衛(wèi)國，E-mail：Xonet5670@163.com

2015-09-15

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