MMP-9在氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成中的表達

底　煜，楊　飏，陳曉隆

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽110004）

MMP-9在氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成中的表達

底煜，楊飏，陳曉隆

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽110004）

目的研究基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）在氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管（RNV）形成中的表達，探討MMP-9抑制劑（GM6001）對RNV形成的抑制作用。方法高氧誘導建立小鼠RNV模型。在出氧箱前1 d（即鼠齡11 d），分別給予GM6001治療組和高氧對照組小鼠玻璃體腔內(nèi)注射GM6001（100 μmol/L）1 μL和等量PBS液，正常對照組和高氧組不做處理。采用HE染色方法觀察RNV情況，采用免疫組織化學、Western blot和RT-PCR法檢測MMP-9蛋白及基因的表達情況。結(jié)果高氧組和高氧對照組可見大量RNV形成，而GM6001治療組RNV形成明顯減少。與正常對照組相比，高氧組和高氧對照組MMP-9蛋白及基因表達水平顯著升高，GM6001治療組較高氧對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論MMP-9的異常表達可能與RNV形成密切相關(guān)，GM6001能有效抑制RNV的形成。

視網(wǎng)膜新生血管；基質(zhì)金屬蛋白酶9；早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變

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早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（retinopathy of prematurity，ROP）是兒童主要的致盲眼病，其病理生理改變的基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）形成［1］。研究表明，在ROP的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞因子發(fā)揮了重要作用。細胞因子基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9），即Ⅳ型膠原酶，能降解變性的膠原和Ⅳ型膠原蛋白，促進內(nèi)皮細胞的遷移、趨化，并促進新生血管的形成［2］，參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［3-5］。但有關(guān)MMP-9在眼部新生血管性疾病中的作用的研究目前較少見，因此，本研究擬通過高氧誘導構(gòu)建小鼠ROP模型，觀察MMP-9蛋白及基因在其RNV中的表達情況，探討MMP-9的抑制劑（GM6001）對RNV形成的作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物與試劑

1.1.1實驗動物及分組：健康清潔級C57BL/6J新生小鼠120只，7日齡，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。將小鼠隨機分為正常對照組、高氧組、高氧對照組和GM6001治療組，每組30只。高氧對照組及GM6001治療組小鼠分別于出氧箱前1 d（即鼠齡11 d）接受玻璃體腔內(nèi)注射1 μL PBS或等量GM6001（100 μmol/L）。注射后立即放回氧箱，1 d后小鼠重新出氧箱。所有小鼠與哺乳母鼠一起飼養(yǎng)，且均遵循視覺與眼科學研究會制定的科研動物使用規(guī)范。

1.1.2主要試劑：兔抗鼠MMP-9多克隆抗體（中國Boster公司）；SABC試劑盒（中國Boster公司）；PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；PCR引物（中國Invitrogen公司）；GM6001（Chemicon公司，美國）。

1.2方法

1.2.1小鼠ROP模型的建立：將高氧組、高氧對照組和GM6001治療組小鼠與母鼠一起置于密封的玻璃容器內(nèi)，測氧儀監(jiān)測調(diào)控氧濃度，氧濃度控制在75%±2%。室內(nèi)使用日光燈照明，明暗周期12 h（06：00～18：00）。高氧環(huán)境下飼養(yǎng)5 d后，回到正?？諝猸h(huán)境中飼養(yǎng)。正常對照組與母鼠一直于正?？諝猸h(huán)境下飼養(yǎng)。選取每組小鼠的左眼作為實驗眼，右眼作為自身對照眼。各組均于出生后17 d處死并進行后續(xù)實驗。

1.2.2視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細胞核計數(shù)：每組取17日齡小鼠15只處死并摘除眼球。4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，HE染色。每只眼球間斷取10個切片，每張切片隨機選取10個不連續(xù)視野，計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)（反映RNV增生的程度［6］）。

1.2.3免疫組織化學法測定MMP-9蛋白的表達：按鏈霉素抗生物素蛋白-生物素復合物（SABC）法說明進行MMP-9免疫組織化學檢測。PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色。MMP-9表達的陽性細胞為細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)有淡黃色至棕褐色著染顆粒。應(yīng)用MetaMorph/Evolution MP5.0/BX51軟件對視網(wǎng)膜中MMP-9陽性細胞進行分析（×400），測定陽性細胞的積分光密度值（IOD），取平均值作為分析指標。

1.2.4Western blot檢測MMP-9蛋白的表達水平：每組取17日齡小鼠15只處死后，收取小鼠視網(wǎng)膜組織，提取視網(wǎng)膜總蛋白。電泳分離轉(zhuǎn)印至纖維素膜上，加堿性磷酸酶標記的二抗雜交，進行化學發(fā)光、顯影和定影，GAPDH作為內(nèi)參照。結(jié)果通過Chemi Imager 5500 V2.03圖像分析系統(tǒng)掃描，F(xiàn)luor Chen 2.0軟件進行整合光密度（IDV）分析。目的蛋白的相對表達量為目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值［7］。抑制效率=（高氧對照組蛋白相對表達量－GM6001治療組蛋白相對表達量）/高氧對照組蛋白相對表達量×100%。

1.2.5RT-PCR檢測MMP-9 mRNA的表達水平：每組各取17日齡小鼠15只處死后，收取小鼠視網(wǎng)膜組織，按照試劑盒說明書提取R NA。每20 μL反轉(zhuǎn)錄體系中加入1 μg總RNA進行反應(yīng)，測cDNA濃度，PCR擴增以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列如下。MMP-9，F(xiàn) 5′-GGAGACCTGAGAAC CAATCTC-3′，R 5′-TCCAATAGGTGATGTCGT-3′，擴增產(chǎn)物長度277 bp；GAPDH，F(xiàn) 5′-CCCATCTATG AGGGTTACGC-3′，R 5′-TTTAATGTCACGCACGA TTTC-3′，擴增產(chǎn)物長度150 bp。反應(yīng)條件：預(yù)熱95℃30 s，95℃變性5 s，60℃退火31 s，72℃延伸2 min，共50個循環(huán)，72℃延伸10 min。MMP-9 mRNA的相對表達量為實驗組目的基因表達相對于對照組的變化倍數(shù)，即2-△△Ct值［8］，而△△Ct=（Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內(nèi)參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因）。抑制效率=（高氧對照組mRNA相對表達量-GM6001治療組mRNA相對表達量）/高氧對照組mRNA相對表達量×100%。

1.3統(tǒng)計學分析

2　結(jié)果

2.1突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核計數(shù)

光鏡下各組17日齡小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰。正常對照組未見明顯突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜新生血管內(nèi)皮細胞核；高氧組和高氧對照組可見數(shù)目不一的血管穿過內(nèi)界膜，進入玻璃體腔，新生血管內(nèi)皮細胞核計數(shù)明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（22.32±2.35，20.13±1.43 vs 3.05±0.78，t1=13.25，t2=11.19，P＜0.05）。GM6001治療組較高氧組和高氧對照組內(nèi)皮細胞核數(shù)明顯減少（6.52±1.07 vs 22.32±2.35，20.13±1.43，t1=10.41，t2=11.15，P＜0.05），見圖1。

圖1　4組17日齡小鼠RNV內(nèi)皮細胞核計數(shù)情況Fig.1 Numbers of retinal neovascularization endothelial cell nuclei in four groups

2.2免疫組化檢測結(jié)果

正常對照組視網(wǎng)膜MMP-9蛋白呈弱陽性表達（19.31±2.45），主要定位于神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層（圖2A）；高氧組和高氧對照組MMP-9蛋白呈強陽性表達（分別為36.13±3.13和35.65±2.65），主要定位于神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層和突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管（圖2B、2C）；GM6001治療組MMP-9蛋白表達（22.17±3.01）較高氧組和高氧對照組明顯減弱，主要定位于神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層（圖2D）。

圖2　免疫組化檢測17日齡小鼠視網(wǎng)膜中MMP-9蛋白的表達×400Fig.2 Protein expression of MMP-9 determined by immunohistochemistry in the retina of 17 d mice×400

2.3Western blot檢測結(jié)果

Western blot檢測4組小鼠視網(wǎng)膜中MMP-9蛋白的表達水平，結(jié)果（圖3）顯示各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=1 525.210，P＜0.05）。正常對照組小鼠視網(wǎng)膜中可以檢測到MMP-9蛋白條帶，表明正常小鼠視網(wǎng)膜中能夠表達MMP-9蛋白（0.24±0.01）；高氧組（2.13±0.02）和高氧對照組（2.04±0.02）表達顯著上調(diào)，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（t1= 3.26，t2=4.14，P＜0.05）。高氧組和高氧對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。GM6001治療組（0.39±0.02）較高氧對照組表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.41，P＜0.05），抑制效率為80.88%。

2.4RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測4組小鼠視網(wǎng)膜MMP-9mRNA表達水平，結(jié)果（圖4）顯示各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=216.503，P＜0.05）。正常對照組視網(wǎng)膜中MMP-9 mRNA表達水平較低（2.04±0.20），高氧組（7.25± 0.16）和高氧對照組（6.25±0.18）較正常對照組表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（t1=2.85，t2=3.57，P＜0.05）。高氧組和高氧對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。GM6001治療組（2.56±0.16）較高氧對照組表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.17，P＜0.05），抑制效率為59.04%。

圖3　Western blot檢測17日齡小鼠視網(wǎng)膜中MMP-9蛋白的表達Fig.3 Protein expression of MMP-9 was determined by Western blot in the retina of 17 d mice

圖4　RT-PCR檢測17日齡小鼠視網(wǎng)膜中MMP-9mRNA表達Fig.4 mRNA expression of MMP-9was determined by RT-PCR in the retina of 17 d mice

3　討論

目前臨床上主要通過全視網(wǎng)膜激光光凝來抑制RNV的發(fā)展，但療效不是很理想，有導致周圍視野和暗視覺喪失等視功能損害的風險［9-11］，因此，亟需新的替代療法以減輕此類不良反應(yīng)，細胞表面受體、靶向生長因子和水解蛋白酶等治療方法應(yīng)運而生［12-13］。

既往認為高濃度氧是導致ROP的重要原因，而目前研究［14］認為ROP的產(chǎn)生與視網(wǎng)膜的“相對缺氧”有關(guān)。制作ROP幼鼠模型時，持續(xù)高氧刺激使幼鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)生可逆性痙攣收縮，小血管閉塞，出現(xiàn)視網(wǎng)膜無灌注區(qū)；當幼鼠返回到正?？諝猸h(huán)境中，視網(wǎng)膜無灌注區(qū)“相對缺血缺氧”，繼而出現(xiàn)RNV增生等類似人類ROP的改變［15］。本研究在前期成功構(gòu)建動物模型的基礎(chǔ)上，探討了MMP-9在ROP模型小鼠RNV形成中的作用，結(jié)果顯示，高氧組和高氧對照組小鼠視網(wǎng)膜中MMP-9蛋白及基因的表達水平明顯上調(diào)，提示MMP-9與ROP小鼠RNV的形成密切相關(guān)。MMP-9在新生血管形成中可發(fā)揮重要作用，但既往的研究多集中于MMP-9與脈絡(luò)膜新生血管、角膜新生血管的相關(guān)性方面，對ROP的研究則相對較少。

GM6001是一種新型的廣譜基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，是已知作用最強的人工合成基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，對MMP-2和MMP-9均有強大的抑制作用。本研究給予小鼠玻璃體腔內(nèi)注射GM6001，有效地抑制了ROP中RNV的形成，因而筆者推測缺血缺氧促進了視網(wǎng)膜組織促血管形成因子的釋放，激活了MMP-9，加快了視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的黏附、遷移和增殖，從而促進RNV形成。而在給予MMP-9抑制劑GM6001后，阻斷了MMP-9信號通路，即使促血管生成因子繼續(xù)存在，也不會發(fā)揮下游功能，從而達到抑制RNV形成的作用。

綜上所述，本研究組初步判斷在缺氧誘發(fā)的RNV形成中，MMP-9發(fā)揮了一定的作用，通過抑制MMP-9能夠抑制RNV的形成。但MMP-9在RNV形成中的具體調(diào)節(jié)過程如何，涉及哪些信號通路的變化等均不十分明確，有待進一步研究探討。

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（編輯王又冬）

Expression of MMp-9 in Mice with Oxygen-induced Retinal Neovascularization

DI Yu，YANG Yang，CHEN Xiaolong
（Department of Ophthalmology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To explore the efficacy of GM6001，tissue inhibitor expression and significance of matrix metalloproteinase-9（MMP-9）in mice model of oxygen-induced retinal neovascularization（RNV）and evaluate the inhibition effect of MMP-9 inhibitor（GM6001）on RNV.Methods Mice were placed in oxygen boxes to establish oxygen-induced RNV animal models.The GM6001 treated or hyperxia control groups

an intravitreal injection of 1 μL GM6001（100 μmol/L）or PBS at day 11 after birth.The normal control and hyperxia group were not treated.HE staining was used to detect RNV in retinal whole mounts，the mRNA level and protein expression of MMP-9 were measured by RT-PCR，Western blot and immunohistochemistry，respectively.Results RNV in the GM6001 treated group was decreased significantly compared with the hyperxia group and hyperxia control group.Compared with the normal control group，higher protein and mRNA expression of MMP-9 were observed in the hyperxia group and hyperxia control group.The expression of MMP-9 protein and mRNA were decreased in the GM6001 treated group compared with the hyperxia control group（P＜0.05）.Conclusion The abnormal expression of MMP-9 was closely correlated with RNV.The development of RNV can be markedly inhibited by MMP-9 inhibitor（GM6001），which，we believe，will provide new molecular targets and therapeutic strategy for retinopathy of prematurity treatment.

retinal neovascularization；MMP-9；retinopathy of prematurity

R774.1

A

0258-4646（2016）05-0409-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.007

國家自然科學基金（81371045）

底煜（1981-），女，講師，博士.

陳曉隆，E-mail：chenxl@sj-hospital.org

2015-12-02

網(wǎng)絡(luò)出版時間：