原癌基因MET啟動子的G-四鏈體結(jié)構(gòu)

閻　敬，關(guān)一夫

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽110122）

原癌基因MET啟動子的G-四鏈體結(jié)構(gòu)

閻敬，關(guān)一夫

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽110122）

目的解析原癌基因MET啟動子中的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并初步探索其功能。方法采用圓二色光譜、紫外吸收光譜、非變性凝膠電泳和PCR Stop實驗分析MET啟動子富含G的Pu23WT序列的G-四鏈體拓撲結(jié)構(gòu)特征，并分析該結(jié)構(gòu)的功能。結(jié)果MET啟動子的Pu23WT序列形成了分子內(nèi)平行型G-四鏈體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠阻滯聚合酶鏈反應(yīng)。結(jié)論原癌基因MET啟動子形成的分子內(nèi)G-四鏈體結(jié)構(gòu)在細胞內(nèi)K+條件下可能負性調(diào)控基因表達。

G-四鏈體；原癌基因MET；基因表達調(diào)控

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人類基因組DNA的主要二級結(jié)構(gòu)是經(jīng)典的B型雙螺旋結(jié)構(gòu)，此外還存在G-四鏈體、三鏈體、i-模體等二級結(jié)構(gòu)類型，DNA結(jié)構(gòu)多樣性與其功能多樣性是密不可分的。上世紀(jì)60年代首次報道了某些富含鳥嘌呤（G）的DNA序列能夠形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)［1］，它是由4個G通過Hoogsteen氫鍵形成G-四分體平面，多個G-四分體平面之間由不同的環(huán)連接成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并且平面中心能夠容納一個陽離子。近年的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在富含G的原癌基因啟動子、mRNA的5′非翻譯區(qū)、核糖體DNA和端粒末端序列等都能夠形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在基因表達調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用。

原癌基因MET位于人類7號染色體長臂（7q31），編碼的MET蛋白（也稱為肝細胞生長因子受體）具有酪氨酸激酶活性［2］。它的激酶活性可被配體肝細胞生長因子、配體非依賴途徑及其他肝細胞生長因子非依賴的受體激活，活化的MET通路通過不同的機制引發(fā)一系列磷酸化反應(yīng)，激活PI-3K、ERK1/2、PLC-γ、STATs、Src和Ras等重要信號通路，從而參與腫瘤的發(fā)生、增殖、分化、血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移過程［3］。

生物信息學(xué)分析揭示：MET啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點近端區(qū)域富含G（啟動子-48～-26核酸序列GC GGGCGGGCGGGGCGCTGGGCT，命名為Pu23WT），可能形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。本研究利用多種生物物理和分子生物學(xué)實驗方法，詳細解析MET啟動子的G-四鏈體結(jié)構(gòu)特點及其在MET基因表達調(diào)控中的作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

MET啟動子富含G區(qū)域的寡核苷酸序列、突變體及引物等由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；Stains-all購自美國Sigma-Aldrich公司；Klenow Fragment購自大連TaKaRa生物技術(shù)公司；UV-Visible分光光度計Cary100購自美國Varian公司；圓二色光譜儀J-810購自日本分光株式會社。

1.2圓二色光譜分析

將MET基因近端啟動子-48～-26的Pu23WT序列及其突變體（表1）制備成pH7.4的寡核酸溶液（5 μmol/L寡核酸，140 mmol/L K+，20 mmol/L二甲胂酸鈉），然后將該溶液在95℃水浴中變性5 min，緩慢冷卻至室溫（約25℃），放置過夜；用空白溶液調(diào)零后，在0.1 cm樣品池中加入500 μL樣品，在室溫掃描200～350 nm的圓二色光譜，每個樣品重復(fù)掃描3次。

表1　Pu23WT及其突變體Tab.1 Pu23WT and its mutants

1.3紫外吸收光譜分析

Pu23WT及其突變體樣品的準(zhǔn)備與采集圓二色光譜的準(zhǔn)備方法相同；空白溶液調(diào)零后，在比色杯中加入150 μL樣品，采集295 nm波長的20～95℃3個循環(huán)的吸光度，分別計算變性與復(fù)性測量結(jié)果的平均值，制作樣品的變性、復(fù)性和fraction folded曲線，并計算解鏈溫度。

1.4非變性凝膠電泳

將用于圓二色光譜測定的寡核酸樣品95℃變性5 min，緩慢冷卻至室溫（約25℃），然后4℃靜置10 min；配制20%非變性聚丙烯酰胺凝膠，4℃緩慢聚合；上樣，待樣品自然沉降后，在4℃50 V電泳15 min，然后4℃120 V電泳約90 min；室溫避光Stains-all溶液中染色過夜，次日曝光約30 min，掃描儀成像。

1.5PCR stop分析

在Pu23WT的3′末端加上9 nt的隨機寡核酸（即Pmet序列：GCGGGCGGGCGGGGCGCTGGGC TATGTTCACG），引物（序列：ATCCAGAAGTACGT GAACAT）與Pmet的3′末端互補，在Klenow Fragment的作用下向兩端延伸，形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。如果Pmet序列形成了G-四鏈體結(jié)構(gòu)，可能抑制Klenow Fragment的聚合作用。分別配制含0 mmol/L、50 mmol/L和140 mmol/L K+的20 μL反應(yīng)體系，室溫反應(yīng)30 min，加入上樣緩沖液終止反應(yīng)；在室溫條件下，15%聚丙烯酰胺凝膠用120 V電壓進行電泳70 min；EB染色5 min，凝膠成像儀成像。

2　結(jié)果

2.1圓二色光譜和紫外吸收光譜

目前圓二色光譜是最簡單、最直接的分析DNA二級結(jié)構(gòu)的常用實驗技術(shù)，并且圓二色光譜能夠區(qū)分G-四鏈體的拓撲學(xué)特征，廣泛用于研究G-四鏈體的構(gòu)型變化。生物信息學(xué)分析提示，在MET啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點近端富含G島的DNA序列中可能形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，為了解析G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成、拓撲結(jié)構(gòu)特點及其穩(wěn)定性，本研究將MET啟動子的Pu23WT序列的不同G島的G逐一突變（表1），然后模擬生理條件檢測Pu23WT及其突變體的圓二色光譜（圖1）。Pu23G7T與Pu23G10T兩個突變體依然保持了與Pu23WT相似的光譜特征：在265 nm附近有正吸收峰，240 nm有負吸收峰，這是平行型G-四鏈體結(jié)構(gòu)的特征性圓二色光譜；突變體Pu23G1T和Pu23G3T在265 nm附近有一個小的正吸收峰、240 nm的負吸收峰以及290 nm附近的肩峰，提示它們形成了混合型G-四鏈體結(jié)構(gòu)；Pu23G12/13T則可能形成了平行型G-四鏈體結(jié)構(gòu)。圓二色光譜的信號強度提示Pu23G7T和Pu23G10T能夠形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，由此推測Pu23WT序列形成了由3層G-四分體堆積而成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，即第1個、第2個和第4個G島以及第3個G島的5′端或者3′端的3個連續(xù)G參與形成了穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。

圖1　Pu23WT及其突變體的圓二色光譜Fig.1 CD spectra of Pu23WT and the mutants

利用紫外分光光度計采集295 nm處的Pu23WT及其突變體升溫、降溫過程的吸收光譜，并比較2個光譜是否擬合。如果完全重合，表明形成的G-四鏈體是單分子的G-四鏈體，反之表明這個G-四鏈體是由多分子形成的。Pu23WT、Pu23G7T與Pu23G10T的升溫與降溫吸收曲線基本可逆（圖2A、2C和2E），說明它們是單分子G-四鏈體結(jié)構(gòu)。根據(jù)升溫、降溫過程的吸收光譜制作fraction folded曲線，計算得到Pu23WT、Pu23G7T與Pu23G10T的解鏈溫度分別為80.32℃、76.02℃和79.57℃（圖2B、2D和2F）。

圖2　紫外吸收光譜和fraction folded曲線Fig.2 UV spectra and fraction folded curves

2.2非變性凝膠電泳結(jié)果

由于Pu23WT及其突變體形成的G-四鏈體空間構(gòu)象不同，分子的緊密程度不同，導(dǎo)致其在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率也不同：分子內(nèi)的G-四鏈體結(jié)構(gòu)的遷移率大于單鏈分子，單鏈分子的遷移率大于分子間G-四鏈體結(jié)構(gòu)。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，通過分析樣品與分子量標(biāo)記物的位置關(guān)系，推測Pu23WT及其突變體是否形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)以及形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)是分子內(nèi)還是分子間構(gòu)型。在140 mmol/L K+溶液中Pu23WT的遷移率大于25 nt單鏈分子，說明Pu23WT形成了分子內(nèi)G-四鏈體結(jié)構(gòu)；其突變體Pu23G7T和Pu23G10T遷移率更大些，也形成了分子內(nèi)的G-四鏈體結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3　140 mmol/L K+溶液中非變性凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Non-denatured electrophoresis assay in the buffer of 140 mmol/L K+

2.3PCR stop電泳結(jié)果

G-四鏈體的每個G-四分體平面中心有一個由4個帶負電荷的氧原子圍成的袋狀結(jié)構(gòu)，具有很強的負電性，帶正電荷的金屬離子或者小分子配體可以與之配位。不同金屬離子能夠誘導(dǎo)同一DNA序列形成特異拓撲結(jié)構(gòu)的G-四鏈體，并且金屬離子能夠提高G-四鏈體的穩(wěn)定性。在多種金屬離子中，已經(jīng)證明K+能夠穩(wěn)定G-四鏈體拓撲結(jié)構(gòu)。在不同濃度的K+溶液中，序列Pmet的Klenow Fragment聚合實驗結(jié)果顯示：無K+的Klenow Fragment體系的擴增效率遠高于有K+的擴增體系（圖4），說明K+促進Pu23WT形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)通過空間位阻效應(yīng)阻滯了Klenow Fragment聚合反應(yīng)的進行。上述結(jié)果顯示，MET啟動子的Pu23WT序列形成在K+的環(huán)境中能夠形成分子內(nèi)平行型G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并且該結(jié)構(gòu)能夠阻滯聚合酶鏈反應(yīng)。

圖4　Pmet的K+濃度依賴的PCR stop實驗Fig.4 PCR stop assay results of Pmet in the presence of K+

3　討論

不同的DNA序列、超螺旋的拓撲結(jié)構(gòu)、離子濃度、DNA結(jié)合蛋白和其他修飾［4］可使DNA瞬時形成非B型雙螺旋結(jié)構(gòu)，例如Z-DNA、三鏈體、十字交叉型、發(fā)夾、G-四鏈體和i-模體結(jié)構(gòu)。有研究證明c-MYC［5］、VEGF［6］、HIF-1α［7］、RET［8］、KRAS［9］、BCL-2［10］和c-MYB［11］等多個原癌基因的啟動子能夠形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并且抑制基因表達，從而抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，減緩腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。由此可見，通過誘導(dǎo)原癌基因啟動子區(qū)域形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)可以抑制基因的表達，進而影響腫瘤細胞的生物學(xué)行為。

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（編輯陳姜）

G-quadruplex Structures in promoters of MET proto-oncogene

YAN Jing，GUAN Yifu
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China）

Objective To identify G-quadruplex structures in the promoter region of MET.Methods CD spectroscopy，UV spectroscopy，nondenatured electrophoresis and PCR stop assay were applied to indicate the G-quadruplex structure and its function.Results The Pu23WT sequence in the promoter of MET adopted an intramolecular parallel G-quadruplex structure under physiological conditions in vitro，which can stop the extension of Pmet.Conclusion G-quadruplex structure in the promoter might inhibit MET gene expression in vivo.

G-quadruplex；MET proto-oncogene；regulation of gene expression

R730.53

A

0258-4646（2016）05-0402-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.005

國家自然科學(xué)基金（31070705）

閻敬（1980-），女，講師，博士.

關(guān)一夫，E-mail：yfguan@mail.cmu.edu.cn

2015-11-27

網(wǎng)絡(luò)出版時間：