常輕膠囊增強免疫力功能實驗研究

朱久新 劉 影 杜智敏

（哈爾濱醫(yī)科大學·150081）

·方藥研究·

常輕膠囊增強免疫力功能實驗研究

朱久新 劉 影 杜智敏

（哈爾濱醫(yī)科大學·150081）

目的： 研究常輕膠囊增強免疫力功能的作用。方法：采用雌性ICR小鼠，設定0.34,0.67，2.01g/kg三個劑量，每日灌胃給予相應樣品，連續(xù)給予30天，檢測動物體重、胸腺、脾臟、ConA誘導的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化、DNFB誘導的DTH、溶血空斑數(shù)、血清半數(shù)溶血值、碳廓清指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞、NK細胞活性的影響。結果：與空白對照組比較，常輕膠囊0.67，2.01g/kg可明顯增強小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應及增強小鼠的碳廓清吞噬指數(shù)，0.67，2.01g/kg可提高小鼠的半數(shù)溶血值和高劑量能增加小鼠的抗體生成細胞, 2.01g/kg可增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能。結論：根據(jù)“保健食品功能學評價程序和檢驗方法”中的判定標準，認為某品牌常輕膠囊具有增強免疫力的功能。

當今自然環(huán)境日趨惡化，社會結構和工作節(jié)奏發(fā)生了巨大的變化，疾病譜也發(fā)生了改變，一些惡性疾?。[瘤等）發(fā)病率呈明顯上升趨勢，促使人們更加關注身體健康與飲食的相互關系，具有保健功能的食品越來越受到重視。保健食品在我國歷史悠久，這是祖國醫(yī)學中有“藥食同源”的理論為指導所致，通過對已報道具有免疫調(diào)節(jié)作用“藥食同源”的傳統(tǒng)中藥進行篩選，我們在傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導下，開發(fā)出具有免疫調(diào)節(jié)功能的常輕膠囊，處方組成為黃芪、山楂、大棗、枸杞子和螞蟻。本文研究了常輕膠囊對小鼠的細胞免疫功能、體液免疫功能、單核巨噬細胞功能和NK細胞活性的影響，為其作為保健品應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康 SPF 級雌性ICR小鼠200 只，體重(20±2) g，購于遼寧長生生物技術有限公司。

藥品與試劑：綿羊紅細胞（SRBC）、雞紅細胞、生理鹽水、補體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑（碳酸氫鈉 1.0g，高鐵氰化鉀0.2g，氰化鉀0.05g，加蒸餾水至1000ml）、印度墨汁、Na2CO3、Hank’s液(pH7.2～7.4)、RPMI 1640完全培養(yǎng)液、小牛血清、青鏈霉素、氧化型輔酶I、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.2)、YAC-1細胞、1% NP40、2-巰基乙醇(2-ME)、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A(ConA)、鹽酸、異丙醇、MTT、PBS緩沖液(pH7.2～7.4)、丙酮、甲醇、Giemsa染液等。

1.1.2 儀器與設備 動物天平、分析天平、冰箱、離心機、722分光光度計、顯微鏡、潔凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標儀、無菌手術器械、游標卡尺(精密度0.01mm)、微量注射器(25μl)、細胞計數(shù)器、紗布、試管、計時器、血色素吸管、24孔培養(yǎng)板等。

1.2 方法

1.2.1 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗和NK細胞活性測定 末次給藥后，無菌取脾臟，制備脾細胞懸液，MTT法測定細胞增殖反應。

1.2.2 NK細胞活性測定(測定法) 末次給藥后，無菌取脾臟，制備脾細胞懸液，LDH法測定NK細胞活性。

NK%=(反應孔OD－自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD－自然釋放孔OD)×100%

1.2.3 遲發(fā)型變態(tài)反應（足跖增厚法） 每只鼠經(jīng)腹腔注射2%（V／V，用生理鹽水配制）壓積SRBC（2000rpm，10分鐘）0.2ml，致敏后4天，測量左后足跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值。然后在測量部位皮下注射20%（V／V，用生理鹽水配制）壓積SRBC 20μl，于注射后24小時測量左后足跖部厚度，以攻擊前后足跖厚度的差值（足跖腫脹度）來表示DTH的程度。

1.2.4 半數(shù)溶血值的測定 在實驗結束前4～5天2%(v/v)的綿羊紅細胞懸液進行動物免疫。免疫4～5天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋250倍，取1ml置試管內(nèi)，依次加入10%（V／V，用SA緩沖液配制）壓積SRBC 0.5ml，補體1ml（用SA緩沖液按1:10稀釋）。另設不加血清的對照管（以SA緩沖液代替）。置37℃恒溫水浴中保溫30分鐘后，冰浴終止反應。2000rpm離心10分鐘，取上清液1ml、加都氏試劑3ml，同時取10%（V／V，用SA緩沖液配制）的壓積SRBC 0.25ml、加都氏試劑至4ml于另一試管中，充分混勻，放置10分鐘后，于540nm波長處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下式計算。

樣品HC50＝樣品光密度值／SRBC半數(shù)溶血時的光密度值×稀釋倍數(shù)

1.2.5 抗體生成細胞檢測。制備脾細胞懸液，采用(Jerne改良玻片法)測定溶血空斑數(shù)。

1.2.6 小鼠碳廓清實驗和臟/體比值的測定。小鼠按0.1ml/10g體重尾靜脈注射1:3.5倍稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2、10分鐘，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，并將其加到2mL Na2CO3溶液中。將小鼠稱重后頸椎脫臼處死，取肝臟、脾臟和胸腺去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。用722分光光度計在600nm波長處測光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白對照。按下式計算吞噬指數(shù)α：

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗。半體內(nèi)法按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬率%=（吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/100個巨噬細胞*100

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/ 100個巨噬細胞

1.3 數(shù)據(jù)處理及結果判定

采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗。如方差齊，計算F值。F值＜F0.05，結論為各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05,P≤0.05，再用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。

2 結果

2.1 常輕膠囊對小鼠脾臟及胸腺系數(shù)的影響

表1 常輕膠囊對小鼠脾臟及胸腺系數(shù)的影響

由表1可見，常輕膠囊對小鼠脾臟及胸腺臟器系數(shù)無影響（p＞0.05）。

2.2 常輕膠囊對小鼠細胞免疫功能的影響

表2 常輕膠囊對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）、淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響

表2 常輕膠囊對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）、淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響

注：與陰性對照組比較有顯著性差異*P＜0.05。

?

由表2可見，常輕膠囊中、高劑量組顯著增加小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應（p＞0.05）。

2.3 常輕膠囊對小鼠體液免疫功能的影響

表3 常輕膠囊對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）、抗體生成細胞的影響

表3 常輕膠囊對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）、抗體生成細胞的影響

注：與陰性對照組比較有顯著性差異*P＜0.05,**P＜0.01。

?

由表3可見，常輕膠囊中、高劑量可顯著提高小鼠的半數(shù)溶血值（p＜0.05及p＜0.01），常輕膠囊高劑量可顯著提高小鼠的抗體生成細胞能力（p＜0.05）。

2.4 常輕膠囊對小鼠單核巨噬細胞功能的影響

表4 常輕膠囊對小鼠碳廓清、雞紅細胞吞噬功能的影響

表4 常輕膠囊對小鼠碳廓清、雞紅細胞吞噬功能的影響

注：與陰性對照組比較有顯著性差異*P＜0.05,**P＜0.01。

?

由表4可見，常輕膠囊中、高劑量可顯著提高小鼠的碳廓清指數(shù)（p＜0.05），常輕膠囊高劑量可顯著提高小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力（p＜0.01）。

2.5 常輕膠囊對小鼠NK細胞活性的影響

表5 常輕膠囊對小鼠NK細胞活性的影響

表5 常輕膠囊對小鼠NK細胞活性的影響

由表5可見，常輕膠囊對小鼠NK細胞活性無影響（p＞0.05）。

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3 討論

在本實驗條件下，我們發(fā)現(xiàn)常輕膠囊0.67，2.01g/ kg·BW可明顯增強小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應及增強小鼠的碳廓清吞噬指數(shù)，0.67，2.01g/kg·BW可提高小鼠的半數(shù)溶血值和高劑量能增加小鼠的抗體生成細胞, 2.01g/kg·BW可增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能。根據(jù)“保健食品功能學評價程序和檢驗方法”中的判定標準，認為某品牌常輕膠囊具有增強免疫力的功能。

黃芪多糖可誘導機體細胞產(chǎn)生相關的體液因子，具有增強腹腔巨噬細胞、淋巴細胞的活性，促進免疫因子的產(chǎn)生[1]；大棗多糖可作為免疫促進劑，能夠控制細胞的分裂和分化，調(diào)節(jié)細胞的生長與衰老；抑制抗體激活促進小鼠脾細胞增殖作用[2,3]。枸杞多糖能夠明顯的提高吞噬細胞的功能，提高T淋巴細胞的增殖能力，增加血清IgG含量，增強補體活性等作用[4，5]。山楂水提取物能夠顯著增強體液免疫及細胞免疫的作用，具有增強補體活性，促進T淋巴細胞轉(zhuǎn)化的活性[6,7]。食用螞蟻含有多種藥用成分。據(jù)廣西中醫(yī)學院等檢測到，鼎突多刺蟻含有多種氨基酸，再加上蛋白質(zhì)水解的蛋氨酸，共種27氨基酸，其中多數(shù)為人體必需的氨基酸。

本研究評價了常輕膠囊增強免疫力的功能，結果表明其有一定的增強免疫力功能，適合免疫力低下人群食用以增強體質(zhì)，為其作為保健食品開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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[2] 吳海霞,李娜,孫元琳.大棗多糖的研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學刊),2009年06期.

[3] 張慶雷，林生、林勤保等.大棗多糖體外抗補體活性劑促進小鼠脾細胞的增殖作用[J].中藥藥理與臨床,1998，14(5)：19-22.

[4] 董進文,胡慶和,高天順,趙迅霞.枸杞多糖的藥理學研究進展[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,1998年05期.

[5] 王琦,張曉丹,張靜蕾.枸杞多糖研究進展[J].食品研究與開發(fā),2009年10期.

[6] 翁毅力.山楂的藥理作用[J].中國藥業(yè),2005年12期.

[7] 江愛龍,劉榮華,陳蘭英等.山楂藥理與臨床研究進展[J].武警醫(yī)學院學報,2009,18(2): 154-158.

（2017-04-11 收稿）