NMR同時定量測定苯二酚三種同分異構體*

趙　丹，敖特根巴雅爾

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學理學院，內(nèi)蒙古　呼和浩特　010018)

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NMR同時定量測定苯二酚三種同分異構體*

趙丹，敖特根巴雅爾

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學理學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

以核磁共振定量測定技術為依據(jù)，以甲酸胺為外標，建立定量測定苯二酚三種同分異構體含量的方法。結果得到鄰、間、對苯二酚均在線性范圍內(nèi)有良好的線性，回歸方程分別：y=-0.00315+40.38201x，r=0.99996；y=0.00254+39.96878x，r=0.99998; y=2.51044E-4+80.31374x，r=0.99992；回收率分別為：100.39%、100.96%、100.09%。本方法取樣量少，直接定量，靈敏度高，方法簡單，重現(xiàn)性好，而且可以同時測定溶液中這三種物質的含量，可作為苯二酚三種同分異構體定量測定的一種簡單方法。

核磁共振(NMR)；鄰苯二酚；間苯二酚；對苯二酚；外標法；含量測定

苯二酚為重要的精細化工原料及中間體，廣泛應用于染料、涂料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及相關化工領域[1-3]。定量測定苯二酚異構體的研究有很多，殷程鵬等[4]用氣相色譜法對鄰苯二酚和對苯二酚進行分析測定；紀曉紅等[5]用高效液相色譜法測定間苯二酚反應液中間苯二酚的含量；吳根華、謝成根、楊繼東等分別用熒光法分析測定了苯二酚異構體的含量[6-8]、吳永軍、孫進高等分別用電化學法分析研究了鄰苯二酚和對苯二酚含量的測定[9-10]。而利用核磁共振法(NMR)對苯二酚異構體進行定量分析的研究相對較少。

盡管 NMR 通常用于結構分析，它正被越來越多的人視為一種重要的定量工具。NMR用于定量分析時最為強大，因為共振信號的積分強度直接與該信號所代表的原子核數(shù)成正比。此外，譜圖中的所有質子均具有相同的靈敏度，因此確定定量結果不再需要特定化合物的消光系數(shù)或校準。NMR 平臺高度穩(wěn)定且線性良好，僅通過濃度外標物的絕對積分和一維譜圖就可以方便地對小分子有機物進行準確而精密的定量核磁(Q NMR)測量。因此，Q NMR越來越多的被應用到各個領域[11-19]。

苯二酚的三種同分異構體因空間結構的差異會在核磁共振氫譜上出現(xiàn)不同的特征峰且互不干擾，使NMR法定量測定苯二酚異構體有了先決條件。因此，本研究利用NMR法定量測定苯二酚異構體，與其他方法相比該方法具有靈敏度高、精密度好、準確度高、且無需對樣品進行復雜的預處理等優(yōu)點。

1　實　驗

1.1儀器與試劑

Bruker AvanceШ 500 型超導核磁共振波譜儀；DV215CD型分析電子天平，感量0.01 mg。

重水(氘代度為99.8%)，美國諾雷爾公司；鄰、間、對苯二酚(分析純，純度99.5%)，北京化工廠生產(chǎn)；甲酸胺(分析純，純度98.0%)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2溶液的配制

準確稱取鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚各110.00 mg分別用D2O溶解于10 ml的容量瓶中并定容，配成0.1 mol/L的標準溶液備用。準確稱取1.57 mg甲酸胺置于毛細管中加D2O完全溶解，并將其密封用作定量分析的外標。

1.3定量方法

測定核磁共振氫譜中外標物峰s的峰面積As，和樣品的峰x的峰面積Ax，按下式計算樣品的含量。

(1)

式中：nx——樣品的對應峰的質子數(shù)

ns——外標峰對應的質子數(shù)

ms——外標物的質量(1.57 mg)

Ms——外標物的摩爾質量(63.06 g/mol)

V——樣品的體積(500 μL)

1.4實驗參數(shù)與儀器的校正

氫譜的弛豫延遲(D1)值為5.0 s，采樣溫度(T)為25 ℃，采樣次數(shù)(NS)為16次。按照上述測定條件調(diào)整儀器，將樣品放入核磁共振波譜儀中，仔細勻場，測定后，調(diào)整相位并進行基線校正，選定外標峰和定量峰，積分，每個樣品至少重復積分5次。

2　結果與討論

2.1溶劑的選取

測試溶劑應選擇對被測樣品和外標物都有很好的溶解性且殘留溶劑峰不造成干擾。通過試驗，本實驗選擇D2O為測試溶劑，該溶劑對鄰、間、對苯二酚和甲酸胺的溶解性都非常好，且其1H NMR譜中的出峰位置在δ4.80處，與其他信號峰沒有干擾，不會對測試結果造成影響(見圖1)。

圖1　鄰、間、對苯二酚溶于D2O的1H NMR譜

2.2外標物的選取

圖2　外標物加入樣品后的1H NMR譜

按照NMR測定的要求，外標物應具有較高的純度，所含質子數(shù)較少，吸收峰處于較低場與所測的樣品峰之間無干擾，按照上訴要求，本實驗選擇甲酸胺為外標物，甲酸胺1H NMR譜只有一個峰(化學位移在δ8.44處)，且與樣品的質子峰無干擾，甲酸胺為外標在樣品中的1H NMR譜見圖2。

2.3定量峰的選取

精密吸取鄰、間、對苯二酚溶液各100 μL,D2O 200 μL于NMR管中，并加入外標毛細管，在上訴實驗條件下測定溶液的1H NMR譜。

利用NMR方法定量分析必須先對1H NMR譜中的各個質子峰進行歸屬，明確每個質子峰對應的質子數(shù)，再選取合適的定量峰。本實驗中，鄰、間、對苯二酚的質子峰均不多(見圖1)，對各個質子峰的歸屬和定量峰的選取見表1。

表1　樣品的質子峰及定量峰的歸屬

2.4線性關系

圖3　鄰、間、對苯二酚的濃度與積分面積的工作曲線

配制不同濃度的鄰苯二酚、間苯二酚和對苯二酚標準系列溶液加入外標物進行測定，以被測物質的濃度為橫坐標、積分面積為縱坐標，繪制其標準曲線。測定結果見圖3。

所得的線性回歸方程分別為：

鄰苯二酚(0.010～0.022 mol/L):

y=-0.00315+40.38201x r=0.99996

間苯二酚(0.010～0.022 mol/L):

y=0.00254+39.96878x r=0.99998

對苯二酚(0.012～0.024 mol/L):

y=2.51044E-4+80.31374x r=0.99992

其中這三種異構體的最低檢測線(LOD)分別為：0.00013 mol/L、0.00009 mol/L、0.00018 mol/L。最低定量限(LOQ)分別為：0.00042 mol/L、0.00030 mol/L、0.00058 mol/L。

根據(jù)核磁共振原理，樣品在任何濃度范圍內(nèi), 質子峰面積與樣品濃度均呈線性。實驗結果表明，用1H NMR法測定鄰、間、對苯二酚，在一定的濃度范圍內(nèi)有很好的線性，與理論依據(jù)相吻合。

2.5回收率的測定

配制不同濃度的鄰苯二酚、間苯二酚和對苯二酚標準系列溶液并加入外標物，測定其回收率。測定結果見表2。

表2　回收率實驗結果

2.6重復性的測定

表3　重復性實驗結果

精密吸取70 μL鄰苯二酚、90 μL間苯二酚和90 μL對苯二酚標準溶液加入250 μL D2O和外標物于NMR管中，平行配制5份樣品，測定其重復性。測定結果見表3，實驗結果表明，該方法的重復性良好。

2.7精密度的測定

精密吸取70 μL鄰苯二酚、90 μL間苯二酚和90 μL對苯二酚標準溶液加入250 μLD2O和外標物于NMR管中，在同一天平行測定5次。測定結果見表4，實驗結果表明，儀器的精密度良好。

2.8穩(wěn)定性的測定

經(jīng)過測定得知，配制的標準溶液在12小時內(nèi)的基本保持穩(wěn)定。測定結果見表5。

表5　穩(wěn)定性實驗結果

按照上述方法進行實驗，結果表明該方法具有簡單快速、重現(xiàn)性好、精密度高、穩(wěn)定性好等特點。

3　結　論

實驗結果表明，采用核磁共振波譜法同時測量溶液中鄰、間、對苯二酚的含量，線性關系、重現(xiàn)性、回收率、精密度和穩(wěn)定性均保持良好。此方法具有高效、簡便、無需對照品等優(yōu)點，結構分析和含量測定可以同時進行，可用運到其他異構體的分析測定。而且，此方法不需要純品做參比標準，選擇合適的溶劑和外標物，即可根據(jù)目標特征峰的積分強度完成定量分析，對此類結構簡單、組分不復發(fā)的異構體混合物的定性定量分析具有重要的意義。但是，核磁共振波譜法不適合復雜組分的樣品分析，因在分析復雜組分時信號峰容易重疊，影響定量定性分析結果。因此，核磁共振波譜法在對復雜組分的定量分析中還需要進一步的研究和發(fā)展。

[1]梁彥秋,孫小寒，馮婧微,等.間苯二酚與牛血清白蛋白的作用機理[J].分析試驗室,2010,29(6):81-84.

[2]王俊君,俞從正,趙衛(wèi)鋒,等.鄰苯二酚對厭氧微生物的毒性作用[J].皮革與化工,2009,26(1):5-9.

[3]雷忻,洪杰,王文強.間苯二酚與鄰苯二酚對泥鰍血清卵黃蛋白原的誘導作用[J].四川動物,2013,32(4):563-566.

[4]殷程鵬,丁欣宇,施磊.鄰苯二酚和對苯二酚的氣相色譜法分析[J].化工環(huán)保,2004,24(S1):384-386.

[5]紀曉紅,張莉,邱娟.高效液相色譜法測定間苯二酚反應液中間苯二酚的含量[J].化學分析計量,2010,19(4):69-70.

[6]吳根華,何池洋,陳榮.人工神經(jīng)網(wǎng)絡用于熒光分析法同時測定苯酚和間苯二酚的含量[J].光譜學與光譜分析,2002,22(5):813-815.

[7]謝成根,吳偉,劉小蘭.雙體系雙波長熒光分析法同時測定廢水中的間苯二酚和對苯二酚[J].冶金分析,2008,28(2):19-22.

[8]楊繼東,張書然,劉紹璞.同步一偏振一導數(shù)熒光法同時測定三種苯二酚異構體的研究[J].化學學報,2007,65(20):2309-2314.

[9]吳永軍.聚苯胺薄膜修飾電極對鄰苯二酚和對苯二酚測定的研究[J].廊坊師范學院學報,2010,10(2):69-73.

[10]孫進高,王廣鳳,焦守峰,等.納米La(OH)3修飾電極對鄰苯二酚和對苯二酚的同時測定[J].分析化學,2007,35(3):335-339.

[11]黃挺,張偉,全燦,等.定量核磁共振法研究進展[J].化學試劑,2012,34(4):327-332.

[12]張友杰,劉小鵬.藥物核磁共振定量分析參數(shù)的研究[J].波普學雜志,2007,24(3):289-294.

[13]孫靜霞，張正行.NMR在藥物定量分析中的應用[J].藥物分析雜志，2005，25(1)：117-122.

[14]M.Malet-Martino,U.Holzgrabe.NMR techniques in biomedical and pharmaceutical analysis[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011,55:1-15.

[15]Erik J.Saude,Carolyn M.Slupsky,and Brian D.Sykes.Optimization of biological fluids for Quantitative accuracy.[J]. Metabolomics,2006,2(3):113-123.

[16]羅虹,朱鳳潤,金燕.NMR法測定復方制劑3組分的相對含量[J].光譜實驗室,2003,20(2):193-195.

[17]閻政禮,楊明生,李添寶,等.蜂蜜中葡糖糖、果糖和蔗糖NMR定量分析研究[J].食品科學2009,30(14):253-255.

[18]Ulrike Holzgrabe.Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications[J].Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,2010,57:229-240.

[19]U. Holzgrabe, R. Deubner, C. Schollmayer, B. Waibel.Quantitative NMR spectroscopy—Applications in drug analysis[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2005,38: 806-812.

Simultaneous NMR Determination of Dihydroxybenzene Isomers*

ZHAODan，Aotegenbayaer

(College of Science, Inner Mongolia Agricultural University, Inner Mogolia Huhhot 010018, China)

Base on quantitative nuclear magnetic resonance technology, taking ammonium formate as external standard, a method to determination of dihydroxybenzene isomers was established.The results of Catechol,Resorcinol,Hydroquinone had the good linearity in linear range. The linear regression equations were as follows:y=-0.00315+40.38201x,r=0.99996,y=0.00254+39.96878x,r=0.99998, y=2.51044E-4+80.31374x,r=0.99992.The recovery rates were as follows: 100.39%, 100.96%, 100.09%.This method is less sampling, direct quantitative， high sensitivity,simple,reproducible,and can simultaneous determine the contents of these three substances in solution.This method can be used for the quantitative determination of dihydroxybenzene isomers.

NMR; Catechol; Resorcinol; Hydroquinone; external standard method;assaying

國家自然科學基金項目(21462030)；內(nèi)蒙古高校研究項目(NJZY051)。

趙丹(1991-)，女，碩士研究生，主要從事儀器分析方面的研究。

敖特根巴雅爾(1960-)，男，教授。

O657.61

A

1001-9677(2016)05-0140-04