LCMSMS法測動物源食品中硝呋烯腙殘留量的不確定度評定

羅艷霞

(上海天祥質(zhì)量技術服務有限公司，上?！?00233)

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LCMSMS法測動物源食品中硝呋烯腙殘留量的不確定度評定

羅艷霞

(上海天祥質(zhì)量技術服務有限公司，上海200233)

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定動物源食品硝呋烯腙的方法，并對其不確定度進行了評定。本文研究了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定動物源食品硝呋烯腙含量的方法，并依據(jù)CNAS-GL06-2006《化學分析中不確定度的評估指南》和JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》規(guī)定的原理與方法，分析了實驗過程中不確定性的來源，建立了不確定度評定的數(shù)學模型，計算并分析了合成不確定度的結(jié)果。由結(jié)果可知：在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定動物源食品硝呋烯腙含量過程中，校準曲線擬合與標準溶液的配置是影響其不確定度的主要因素，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和測量重復性是次要因素。

LCMSMS；動物源性食品；硝呋烯腙；不確定度

我國是畜牧業(yè)大國，隨著人們對動物源食品由需求型向質(zhì)量型的轉(zhuǎn)變，動物源食品中的獸藥殘留已逐漸成為全世界關注的一個焦點[1]。目前在養(yǎng)殖過程中，普遍濫用藥物添加劑或高效抗生素等成為影響動物源性食品安全的主要原因。隨著人們對食品與環(huán)境質(zhì)量要求的不斷提高及對抗生素認識的不斷深入，飼料中抗生素的添加所引起的問題愈來愈引起人們的關注。

硝呋烯腙 (Nitrovin)是20世紀70年代中期發(fā)現(xiàn)的一種新型抗生素，它是一種呋喃類化學合成藥物,它通過增加動物腸粘膜的通透性，從而能有效地提高營養(yǎng)物質(zhì)在動物消化道中的消化和吸收；還能夠有效抑制動物消化道內(nèi)病原微生物對葡萄糖的利用，使其新陳代謝過程受阻，從而抑制和殺滅多種病原微生物，減少動物感染疾病的機會，提高抗病能力[2]。由于抗生素的耐藥性、殘留和二重感染的特性，所帶來的弊端和危害已成為人類所面臨的重大挑戰(zhàn)。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部國家藥品監(jiān)督管理局公告(第193號)：食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單明確指出硝呋烯腙禁止使用。因此，研究建立動物源性食品中硝呋烯腙的殘留檢測方法具有重要意義。

目前有關檢測動物源性食品中的硝呋烯腙殘留量的方法有高效液相色譜法[3]，高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法[4-5]等少量的文獻報道，國家也尚未制定相關的檢測標準。本文建立了硝呋烯腙的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其中硝呋烯腙色譜峰保留時間是3.47min, 線性范圍是1.0～50ng/mL，相關系數(shù)R為0.999。該方法實驗過程簡單，有利于食品檢測機構(gòu)的批量檢驗。并且依據(jù)CNAS-GL06-2006《化學分析中不確定度的評估指南》[6]和JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[7]規(guī)定的原理與方法，對本文測試方法的準確可靠性進行了詳細的分析，用合成不確定度[8-13]為測量結(jié)果提供理論基礎和科學依據(jù)。

1　實　驗

1.1材料

1.1.1試劑

硝呋烯腙標準品，Dr.Ehrenstorfer； 乙腈(色譜純)，F(xiàn)isher；甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher；甲酸(分析純)，國藥；二甲基甲酰胺(分析純)，國藥。

1.1.2儀器

AB4500型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測儀，ABSCIEX公司；FE20K型酸度計、MS204S型電子天平、XS105型電子天平，瑞士梅特勒托利多；SF-DL-4M型高速冷凍離心機，上海菲恰爾分析儀器公司；SK250H型超聲振蕩儀，上?？茖С晝x器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制

精密稱取10.00mg硝呋烯腙標準品，置于100mL容量瓶中，加入2mL二甲基甲酰胺溶解，再用甲醇定容，混勻，得到標準儲備溶液。用單標線刻度為1mL的移液管準確移取0.1mL標準儲備溶液至100mL容量瓶中，甲醇釋至刻度，混勻，此標準中間液濃度為 100ng/mL；再用10mL刻度移液管分別移取0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL100μg/mL的標準中間液于5只10mL容量瓶中，甲醇釋至刻度，混勻，配置成的標準工作液濃度分別為1.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL(注：此處移液管、容量瓶均為A級)。

1.2.2樣品預處理

精密稱取5.0000g樣品于50mL離心管中，用A級10mL刻度移液管吸取6mL二甲基甲酰胺加入離心管，振搖分散樣品，再加入9mL乙腈，超聲提取20min，4000r/min冷凍離心10min，過0.45和0.22μm有機膜，供LC-MS-MS分析測定。

1.2.3儀器條件

1.2.3.1液相色譜條件

表1　流動相梯度條件Table 1　Mobile phase gradient conditions

色譜條件：色譜柱為AgilentC18(4.6x250mm, 5μm)；進樣量10μL；流速為0.3mL/min；柱溫為 30 ℃；流動相A相甲醇，B相0.1%甲酸水溶液(見表1)。

1.2.3.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧(ESI+)離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；電壓：5500V；霧化氣壓力：50psi；氣簾氣壓力：35psi；輔助氣壓力：50psi；碰撞氣壓力：9psi；離子源溫度：500 ℃；碰撞室入口電壓：10V；碰撞室出口電壓：6V；硝呋烯腙最佳碰撞電壓、碰撞能量等如表2所示。

表2　硝呋烯腙的離子對Table 2　The ion pair of nitrovin

1.3數(shù)學模型的建立[8-9]

樣品中硝呋烯腙含量計算公式如下：

式中: X——樣品中硝呋烯腙含量，μg/kg

C——樣品溶液中硝呋烯腙濃度,ng/mL

V——樣品定容體積，mL

m——樣品質(zhì)量，g

上述計算公式是由測量原理得到的，沒有考慮各種隨機因素對不確定度的影響，在此引入反映隨機影響的重復性系數(shù) frep，其數(shù)值等于1。評定不確定度的數(shù)學模型應寫成如下形式：

1.4測量不確定度因素[8-13]

依據(jù)檢測過程和數(shù)學模型，不確定度的主要因素有：實驗重復性條件產(chǎn)生的相對標準不確定度uref(frep);樣品稱樣量產(chǎn)生的相對標準不確定度uref(m);樣品定容體積引起的相對標準不確定度uref(V);標準溶液配制引起的相對標準不確定度uref(C);校準曲線擬合引起的相對標準不確定度uref(Co); 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀定量重復性產(chǎn)生的相對標準不確定uref(LCMSMS)。合成相對標準不確定度uref(X)計箅公式如下：

2　結(jié)果與討論

2.1實驗重復條件下產(chǎn)生的相對標準不確定度uref(frep)

對樣品進行7次重復測定所得到數(shù)據(jù)如表3所示。

表3　樣品測定結(jié)果Table 3　Samples determination results

重復測量7次的實驗標準偏差為：

日常測量時為平行測定，結(jié)果是平均值，故平均值相對標準不確定度為：

實驗重復條件下產(chǎn)生的標準偏差，考慮了所有的隨機影響。因此在分析之后的各因素時，無需考慮隨機影響。

2.2樣品稱樣量的相對標準不確定度uref(m)

用天平稱取5.0000g樣品時，因天平所允許的最大誤差為±0.0001g, 按矩形分布分析，稱樣時天平引入的相對標準不確定度為：

2.3樣品定容體積的標準不確定度uref(V)

2.4硝呋烯腙標準溶液的相對標準不確度uref(C)

2.4.1配制標準儲備液所引入的相對標準不確定度uref(C1)

(1)由硝呋烯腙標準品證書可知其純度為98.5%，由標準品純度引入的不確定度為：

(2) 準確稱取標準品硝呋烯腙時，天平所允許的最大誤差為±0.01mg, 按矩形分布分析，天平引入的相對標準不確定度為：

(4)因此配制標準儲備液時所引入的相對標準不確定度uref(C1)為：

2.4.2配制標準中間液所引入的相對標準不確定度uref(C2)

2.4.3配制標準工作液所引入的相對標準不確定度uref(C3)

依據(jù)JJG196-2006[14]常用玻璃量器檢定規(guī)程,據(jù)三角形分布分析,配制標準工作液所引入的相對標準不確定度uref(C3)見表4[9]。

表4　標準工作液配制引入的相對標準不確定度Table 4　The introduction of relative standard uncertainty of standard working liquid

①按三角分布分析，研討溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度0.00048，可知uref(VAi)為：

②按三角分布分析，研討溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度0.00048，可知uref(VBi)為：

③綜合以上得到相對標準不確定度uref(C3)：

2.4.4配制硝呋烯腙標準溶液的相對標準不確定度uref(C)

2.5校準曲線擬合引入的相對標準不確定度uref(Co)

用LCMSMS測定硝呋烯腙標準溶液5個濃度水平，可知相應的峰面積，運用最小二乘法擬合，擬合方程Y=aC+b和相關系數(shù)r(見表5)。

表5　測定及由擬合方程計算結(jié)果Table 5　Measurement and calculation results by fitting equations

注：a=35242,b=2406,r=0.999。

依據(jù)擬合的標準曲線，將樣品測定10次，得到的樣品溶液濃度測定結(jié)果表6所示。

表6　樣品溶液濃度測定結(jié)果Table 6　Sample solution concentration determination results

計算可知：C0=7.826ng/mL，X=23.48μg/kg

由標準曲線求濃度時的相對標準不確定度uref(C0)由下式計算[9]：

式中：a——標準工作曲線的斜率

P——重復測定樣品的數(shù)量

m——重復測定標準溶液的數(shù)量

n——配制的標準溶液數(shù)量

Sy/c——工作曲線的標準偏差

Sc/c——工作曲線各濃度點的離均差平方和

Yij——工作曲線各濃度點的測定響應值

Yi——由線性方程計算所得響應值

Ci——工作曲線各濃度點

C0——測試樣平均濃度

由以上公式計算的結(jié)果見表7。

表7　最小二乘法擬合標準曲線時引入的不確定度uref(C0)Table 7　Least squares fitting in uncertainty of standard curve

2.6液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在測量過程中所引入的相對標準不確定度uref(LCMSMS)

2.7合成相對標準不確定度及評定擴展不確定度

2.7.1合成相對標準不確定度

依據(jù)文中各項不確定度分量(見表8)，合成得到相對標準不確定度uref(X):

=0.0548

表8　各相對標準不確定度分量匯總表Table 8　Each relative standard uncertainty componentssummary table

2.7.2擴展不確定度

當包含因子k=2,置信水平約為95%,依據(jù)公式計算可得相對擴展不確定度uref(X):

Uref(X)=uref(X)×k=0.1096

依據(jù)表6計算得，動物源性樣品中硝呋烯腙測定的殘留量的最佳預估值為23.48μg/kg，故其擴展不確定度U為：

U=23.48×Uref(X)=2.6μg/kg

3　結(jié)　論

本實驗采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性樣品中硝呋烯腙殘留量，當k=2，置信水平是95%時，測得的硝呋烯腙含量為(23.48±2.6)μg/kg。本文中實驗過程簡單易行，用來對動物源性食品中硝呋烯腙的測定準確可靠性較高。

對實驗過程及不確定度分量結(jié)果綜合分析可知：在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定動物源食品硝呋烯腙殘留量過程中，校準曲線擬合與標準溶液的配置是影響其不確定度的主要因素，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和測量重復性是次要因素。

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Uncertainty Evaluation for the Determination of Nitrovin Residues inAnimal-originFoodbyLiquidChromatographyTandemMassSpectrometry

LUO Yan-xia

(Shanghai Intertek Testing Services Co., Ltd., Shanghai 200233, China)

AliquidchromatographytandemmassspectrometrydeterminationofNitrovinresiduesinanimal-originfoodwasestablished,andthemeasurementuncertaintyofthismethodwasevaluated.Theliquidchromatography-tandemmassspectrometrydeterminationofanimaloriginfoodmethodofnitrovincontentwasstudied,accordingtotheprincipleandmethodinCNAS-GL06-2006GuidanceonEvaluatingtheUncertaintyinChemicalAnalysisandJJF1059.1-2012EvaluationandExpressionofUncertaintyinMeasurement,thesourceofuncertaintyintheexperimentprocesswasanalyzed,themathematicalmodelofuncertaintyevaluationwasestablished,theresultofthesynthesisofuncertaintywascalculatedandanalyzed.Theresultsshowedthatinthedeterminationofanimaloriginfoodofnitrovincontentintheprocess,calibrationcurvefittingandtheconfigurationofthestandardsolutionwerethemainfactorsaffectingtheuncertainty,liquidchromatography-tandemmassspectrometerandrepeatabilityweresecondaryfactors.

LCMSMS;animal-originfood;nitrovin;uncertainty

羅艷霞，女，本科，主要從事食品檢測工作。

O657.7+2

A

1001-9677(2016)013-0136-05