呼吸道感染細(xì)菌聯(lián)合疫苗體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

李樹(shù)義，鮑承賢，張　敬

(1.河北省唐山市第九醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 唐山 063000；2.河北省承德市雙橋區(qū)疾病預(yù)防控制中心計(jì)免科，河北 承德 067000；3.河北省唐山市中心血站檢驗(yàn)科，河北 唐山 063000)

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·論著·

呼吸道感染細(xì)菌聯(lián)合疫苗體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

李樹(shù)義1，鮑承賢2，張敬3

(1.河北省唐山市第九醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 唐山 063000；2.河北省承德市雙橋區(qū)疾病預(yù)防控制中心計(jì)免科，河北 承德 067000；3.河北省唐山市中心血站檢驗(yàn)科，河北 唐山 063000)

目的通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，觀察其對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，為研制我國(guó)呼吸道感染細(xì)菌聯(lián)合疫苗提供理論依據(jù)。方法①分離培養(yǎng)我國(guó)小兒呼吸道感染常見(jiàn)6種細(xì)菌，按洗滌、超聲波破碎、沉淀、透析、分光光度計(jì)測(cè)定等過(guò)程制備細(xì)菌蛋白，等量混合配成一定濃度作為實(shí)驗(yàn)用聯(lián)合疫苗。②取無(wú)特定病原體級(jí)小鼠40只，隨機(jī)分成4組，每組10只。全部實(shí)驗(yàn)小鼠飼喂基礎(chǔ)日糧，適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后，實(shí)驗(yàn)組分別用濃度為0.1、0.2、0.4 g/L聯(lián)合疫苗免疫，每天上午灌服0.2 mL。對(duì)照組每天灌服0.2 mL生理鹽水。免疫10 d。處死小鼠，分別測(cè)定聯(lián)合疫苗組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能、細(xì)胞免疫功能、血清中溶血素含量以及胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響。結(jié)果聯(lián)合疫苗組的巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)、左右后足質(zhì)量差、溶血素吸光度值、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)疫苗濃度范圍各組中，不同組間檢測(cè)值隨疫苗濃度的增加而加大，且各實(shí)驗(yàn)組間也均存在明顯差異(P<0.05)。結(jié)論制備的聯(lián)合疫苗可提高機(jī)體免疫功能，不僅能提高細(xì)胞免疫功能，對(duì)體液免疫功能也具有明顯影響，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，疫苗濃度越高對(duì)機(jī)體免疫功能影響越明顯。

呼吸道感染；疫苗；免疫

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.06.020

細(xì)菌和病毒均可引起呼吸道感染，病毒感染后可繼發(fā)細(xì)菌感染，臨床治療多應(yīng)用抗生素，因藥物品種的選擇和劑量問(wèn)題，可導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性或菌群失調(diào)。利用免疫制劑預(yù)防或治療呼吸道感染，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，是需要深入研究的課題[1-2]。蘭菌凈、泛福舒、必思添等制劑是將引起呼吸道感染的常見(jiàn)細(xì)菌經(jīng)過(guò)特殊處理，制成的聯(lián)合細(xì)菌混懸液。蘭菌凈由溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌B型制成，具有很好的抗原性，但由于地域、種族和不同的生活習(xí)慣，且制備蘭菌凈的細(xì)菌均來(lái)自英國(guó)菌株中心，其可能更適合歐洲白人應(yīng)用；另外，進(jìn)口疫苗價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)需自費(fèi)接種，影響了此類疫苗的普及。所以，研制和生產(chǎn)一種針對(duì)我國(guó)預(yù)防和治療呼吸道感染疾病的價(jià)格合理、效果更佳的疫苗勢(shì)在必行。本研究以此為理論基礎(chǔ)，制備呼吸道感染細(xì)菌聯(lián)合疫苗，并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)聯(lián)合疫苗的免疫學(xué)效果進(jìn)行檢測(cè)[3]?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康昆明種小鼠，無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。實(shí)驗(yàn)用公雞：由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。取SPF級(jí)小鼠40只隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照組，聯(lián)合疫苗1組，聯(lián)合疫苗2組，聯(lián)合疫苗3組，每組各10只。全部實(shí)驗(yàn)小鼠飼喂基礎(chǔ)日糧，適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后，分別用濃度為0.1、0.2、0.4 g/L聯(lián)合疫苗免疫1組、2組、3組小鼠，每天上午灌服0.2 mL[4-5]；對(duì)照組小鼠每天灌服生理鹽水0.2 mL。免疫10 d。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求處死小鼠，進(jìn)行檢測(cè)。

1.2主要試劑蛋白胨溶液(湖北興銀河化工有限公司)，氯化鈉注射液(山東齊都藥業(yè)有限公司)，75%乙醇(滄州鑫安化工產(chǎn)品有限公司)。

1.3主要儀器設(shè)備HR60-ⅡA2生物安全柜(青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司)，超聲波破碎儀SONIFIER(北京星越天成科技有限公司)，高速臺(tái)式離心機(jī)TGL-16B(上海安亭科學(xué)儀器廠)，電子精密天平CPA124S(上海恒磁電子科技有限公司)，臺(tái)式離心機(jī)TDL-40B(上海安亭科學(xué)儀器廠)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀SpectraPlus384(美國(guó)Molecular Devices公司)，分光光度計(jì)D-8PC(南京菲勒儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡CHC-212(日本奧林帕斯公司)。

1.4菌種來(lái)源由開(kāi)灤總醫(yī)院收集細(xì)菌，在華北理工大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)。

1.5聯(lián)合疫苗的制備從臨床上分離培養(yǎng)呼吸道感染常見(jiàn)6種細(xì)菌(同蘭菌凈菌株)，等質(zhì)量混合，然后裝入無(wú)菌的離心管中，分別用生理鹽水洗滌，用天平調(diào)平后，以3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，反復(fù)3次，取最后沉淀物用生理鹽水稀釋后，用超聲波破碎儀將細(xì)菌分別破碎，用移液管加飽和硫酸銨到破碎細(xì)菌混合液中，混勻，沉淀細(xì)菌蛋白，利用透析膜除去硫酸銨，分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量，用細(xì)菌蛋白作為抗原[6]。按比例將抗原混合用0.9%生理鹽水配置成實(shí)驗(yàn)要求濃度即為實(shí)驗(yàn)用聯(lián)合疫苗。

1.6雞紅細(xì)胞懸液的制備將雞翼下靜脈取血部位用75%酒精消毒后，用注射器抽取靜脈血，將雞血置于肝素抗凝管中。然后取抗凝血3 mL加入裝有12 mL生理鹽水的離心管中，混勻后2 000 r/min離心15 min。棄掉上清，再在離心管中加入12 mL生理鹽水，混勻后2 000 r/min離心15min。棄掉上清后，通過(guò)同樣方法再洗滌1次，其沉積物即為雞紅細(xì)胞。隨后立即取1 mL雞紅細(xì)胞加入9 mL生理鹽水中，充分混勻，此溶液即為體積比為10%雞紅細(xì)胞懸液。

1.7巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)前每天9：00向小鼠腹腔內(nèi)注入1%的蛋白胨溶液1次，共3次，末次注射24 h后，將1 mL 10%的雞紅細(xì)胞懸液注射入小鼠腹腔，30 min后，將小鼠頸椎脫臼處死，再向腹腔注入生理鹽水2 mL，輕輕按摩小鼠腹部1 min。打開(kāi)小鼠腹腔，吸取1 mL腹腔液，均勻涂在潔凈載玻片上，37℃溫箱孵育30 min。漂洗掉未貼片細(xì)胞，晾干，甲醇固定，用瑞氏染液濃染2 min，加入等量緩沖液淡染3 min，沖洗干凈后晾干。顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞吞噬情況，并按下式計(jì)算。吞噬率=(吞噬雞紅細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)÷計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù))×100%。吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)÷計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)

1.8遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)定適應(yīng)性喂養(yǎng)各組小鼠2周后，將50 μL 10%(v/v)CRBC懸液注入每只小鼠的左后足掌，將等量生理鹽水注射入右后足掌。待24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，沿相同部位切下小鼠雙后足，用電子天平精確稱其質(zhì)量，計(jì)算左右后足質(zhì)量差。

1.9血清溶血素含量測(cè)定取SPF級(jí)小鼠40只，按照1.6中分組及免疫小鼠，處死小鼠后摘除眼球取血，分離血清，用生理鹽水稀釋500倍待測(cè)。取稀釋的血清1 mL，10%雞紅細(xì)胞0.5 mL，10%的補(bǔ)體1 mL，依次加入試管內(nèi)，混勻。用混勻的稀釋血清作對(duì)照，置37℃恒溫水浴箱中反應(yīng)30 min，然后移至冰浴中使反應(yīng)終止，2 000 r/min離心10 min，取上清液于λ540 nm處比色測(cè)吸光度值。

1.10小鼠免疫器官指數(shù)測(cè)定電子天平分別稱取小鼠體質(zhì)量；濾紙吸干取出的脾臟、胸腺表面血液，用精密電子天平分別稱其質(zhì)量。免疫器官指數(shù)=脾臟(胸腺)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)疫苗濃度范圍各組中，聯(lián)合疫苗1、2、3組與對(duì)照組相比，聯(lián)合疫苗2、3組與聯(lián)合疫苗1組間相比，小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)、左右后足質(zhì)量差、溶血素含量、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著提高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表14組各項(xiàng)觀察指標(biāo)比較

組別吞噬率(%)吞噬指數(shù)左右后足質(zhì)量差(mg)溶血素D(λ)脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)對(duì)照組 22.5±1.950.32±0.0216.50±2.120.205±0.0234.92±0.231.53±0.32聯(lián)合疫苗1組27.3±1.65*0.46±0.02*21.60±2.07*0.229±0.018*5.64±0.30*2.16±0.24*聯(lián)合疫苗2組30.24±2.10*#0.57±0.04*#23.36±2.65*0.236±0.022*5.93±0.28*#2.56±0.31*#聯(lián)合疫苗3組35.29±2.65*#△0.65±0.05*#△25.63±3.02*#0.258±0.015*#△6.30±0.32*#△2.96±0.46*#△F 6.7814.9735.6253.9365.3057.582P 0.0010.0010.0010.0030.0010.001

*P<0.05與對(duì)照組比較#P<0.05與聯(lián)合疫苗1組比較△P<0.05與聯(lián)合疫苗2組比較(SNK-q檢驗(yàn))

3　討　　論

免疫制劑能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，減少不良反應(yīng)，能有效地預(yù)防和治療呼吸道感染。本研究利用引起小兒呼吸道反復(fù)感染的6種常見(jiàn)菌制備聯(lián)合疫苗，進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察聯(lián)合疫苗對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。

巨噬細(xì)胞可識(shí)別和清除病原體等抗原性異物，參與和促進(jìn)炎癥反應(yīng)，對(duì)腫瘤和病毒感染等靶細(xì)胞具有殺傷作用，可加工提呈抗原，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，活化的巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)[7]。細(xì)菌溶解產(chǎn)物能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的趨化作用，增加IL-2和IFN-γ的分泌量，提高T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活性，同時(shí)增強(qiáng)單個(gè)核細(xì)胞和多核細(xì)胞的吞噬功能[8-9]。實(shí)驗(yàn)聯(lián)合疫苗的作用機(jī)制與蘭菌凈、泛福舒相似，可能是通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)淋巴因子釋放，激活T淋巴細(xì)胞和促使B細(xì)胞向漿細(xì)胞成熟轉(zhuǎn)化，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生淋巴因子、漿細(xì)胞使IgA和自然殺傷細(xì)胞活性增強(qiáng)，提高機(jī)體免疫力[10-11]；也可能是通過(guò)激活黏膜源性淋巴組織，使其分泌補(bǔ)體及細(xì)胞活素，刺激氣管黏膜分泌免疫球蛋白，肺、腸分泌的IgA 濃度增加，提高呼吸道分泌型IgA(SIgA)及肺的巨噬細(xì)胞活性，通過(guò)特異性、非特異性細(xì)胞和體液機(jī)制增強(qiáng)免疫系統(tǒng)反應(yīng)的效應(yīng)，并可獲得長(zhǎng)期非特異性免疫保護(hù)作用，對(duì)反復(fù)呼吸道感染可起到預(yù)防和治療的目的[12-13]。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)執(zhí)行非特異性免疫作用的效應(yīng)細(xì)胞，其吞噬指數(shù)是衡量機(jī)體非特異性免疫功能指標(biāo)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍各組中，聯(lián)合疫苗組與對(duì)照組相比，聯(lián)合疫苗高濃度組與低濃度組間相比，小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)得到明顯提高。說(shuō)明制備的聯(lián)合疫苗可以提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)正常小鼠非特異性免疫功能，且隨濃度的升高免疫功能加強(qiáng)。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)也稱Ⅳ超敏反應(yīng)，為變態(tài)反應(yīng)的一種。本研究采用雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，觀察小鼠左右后足質(zhì)量差異(即足墊部腫脹程度)來(lái)衡量細(xì)胞免疫功能[16]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合疫苗組小鼠左右后足質(zhì)量差與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)高濃度組與低濃度組相比，檢測(cè)數(shù)據(jù)均明顯增高。說(shuō)明制備的聯(lián)合疫苗對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用，且隨濃度的增高免疫功能增強(qiáng)。

溶血素是B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，分化成漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體?？贵w是機(jī)體殺滅病原菌和清除外來(lái)抗原的重要活性物質(zhì)，主要存在于體液中，是體液免疫反應(yīng)的標(biāo)志。本研究采用雞紅細(xì)胞免疫小鼠，致使小鼠血清溶血素抗體生成，其生成量可代表抗體生成總量，從而觀察聯(lián)合疫苗對(duì)小鼠體液免疫功能的影響[17]。溶血素與雞紅細(xì)胞、補(bǔ)體在37 ℃發(fā)生反應(yīng)，雞紅細(xì)胞溶解。紅細(xì)胞破裂釋放出的血紅蛋白使溶液變成紅色，顏色越深，血紅蛋白滲出量越多，且吸光度值與溶血素含量正相關(guān)，測(cè)定上清液的吸光度值，可間接反映血清中溶血素的含量，從而反映機(jī)體的體液免疫水平。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合疫苗組比對(duì)照組吸光度值顯著增高，實(shí)驗(yàn)疫苗高濃度組與低濃度組相比吸光度值也明顯增高。表明此聯(lián)合疫苗可顯著提高小鼠體液免疫功能，且隨實(shí)驗(yàn)濃度的增高體液免疫功能增強(qiáng)。

免疫器官是實(shí)現(xiàn)免疫功能的器官或組織，是免疫細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育以及產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所，當(dāng)免疫器官生理性體積增大，免疫細(xì)胞數(shù)量增多，機(jī)體的免疫功能與抵抗力也會(huì)相對(duì)增強(qiáng)。因此，促進(jìn)免疫器官質(zhì)量增加，必定對(duì)機(jī)體免疫力起到提高的作用[18]。從本研究結(jié)果可以看出，用聯(lián)合疫苗免疫后，小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著提高，隨濃度的升高其檢測(cè)指數(shù)也明顯升高。說(shuō)明聯(lián)合疫苗可以促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞增殖，提高機(jī)體免疫功能，且隨濃度的升高而加強(qiáng)。

總之，通過(guò)一系列體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明利用呼吸道常見(jiàn)感染細(xì)菌制備的聯(lián)合疫苗，對(duì)機(jī)體非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫均有明顯提高，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)隨疫苗濃度的升高而增強(qiáng)免疫力。同時(shí)證明利用我國(guó)上呼吸道感染的常見(jiàn)細(xì)菌，能夠成功制備細(xì)菌聯(lián)合疫苗，這為我國(guó)聯(lián)合疫苗的研制提供了理論依據(jù)。

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(本文編輯：劉斯靜)

In vivo experimental study of bacteria combined vaccine in respiratory tract infection

LI Shu-yi1, BAO Chen-xian2, ZHANG Jing3

(1.Department of Clinical Laboratory,the Ninth Hospital of Tangshan City,Tangshan 063000, China;2.Department of Planned Immunization, Prevention and Control Center of Shuangqiao, Chengde 067000, China; 3.Department of Clinical Laboratory, Blood Center of Tangshan City, Tangshan 063000, China)

ObjectiveThe immune function of the mice was detected through theinvivoexperiment in mice, which will provide theoretical basis for the development of the bacterial combined vaccine of respiratory tract infection in our country. Methods①Six common bacterias in children with respiratory tract infection in our country were isolated and cultured. Bacterial proteins were prepared by washing, ultrasonic crushing, precipitation, dialysis and spectrophotometer, and the equivalent amount of the mixture was used as the experimental combined vaccine. ②Forty specific pathogen free mice were randomly divided into four groups, with 10 rats in each group. All mice were fed with a basal diet.After adaptive feeding for 10 days, the experimental group were fed with concentrations of 0.1, 0.2, 0.4 g/L combined vaccine, with daily morning irrigation of 0.2 mL. The mice in normal control group were orally administered daily with physiological saline 0.2 mL. All groups were immuned for 10 days. Effects of combined vaccine on the phagocytic function of macrophage,the cellular immune function of mice, the changes of serum hemolysin content and the effect of thymus index and spleen index determinated. ResultsCompared with the normal control group, the macrophage phagocytic rate and phagocytic index,left and right foot weight, the absorbance value of serum hemolysin, the spleen index and thymus index of combined vaccine groups were significantly increased(P<0.05). In the experimental design of vaccine concentration range, the detection values in different groups were increased with the increasement of vaccine concentration, and there were significant differences among the test groups(P<0.05). ConclusionCombined vaccine can improve the immune function of organism. Combined vaccine can not only improve the cellular immune function, but also has obvious effect on humoral immune function. In the experimental concentration range, the higher the vaccine concentration, the more obvious effect on the immune function of the body.

respiratory tract infections； vaccines； immunity

2015-11-02；

2015-12-11

李樹(shù)義(1974-)，男，滿族，河北青龍人，河北省唐山市第九醫(yī)院副主任檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床檢驗(yàn)學(xué)研究。

R517.6

A

1007-3205(2016)06-0693-04