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    高效液相色譜法檢測蜂蜜中大米糖漿摻假

    2016-09-02 06:32:02張其安楊少波王坤丁曉敏盧德梅山東華康蜂業(yè)有限公司日照76500山東華瀚食品有限公司日照7686咸陽健康蜂業(yè)有限公司咸陽7400
    中國蜂業(yè) 2016年1期
    關(guān)鍵詞:糖漿蜂蜜回收率

    張其安楊少波王坤丁曉敏盧德梅(山東華康蜂業(yè)有限公司,日照76500;山東華瀚食品有限公司,日照7686;咸陽健康蜂業(yè)有限公司,咸陽7400)

    高效液相色譜法檢測蜂蜜中大米糖漿摻假

    張其安1楊少波1王坤2丁曉敏2盧德梅3
    (1山東華康蜂業(yè)有限公司,日照276500;2山東華瀚食品有限公司,日照276826;3咸陽健康蜂業(yè)有限公司,咸陽713400)

    建立了反相色譜快速測定蜂蜜中大米糖漿含量的分析方法。蜂蜜樣品用水溶解后,直接上樣至C18固相萃取柱凈化,甲醇洗脫。洗脫液經(jīng)濃縮、溶解、過濾后進行HPLC分析。采用Sinochrom ODS-BP柱,以水+乙腈=93+7為流動相,紫外檢測波長300nm,外標法定量。結(jié)果表明,蜂蜜中大米糖漿摻假檢出限(LOD)為20mg/m l,在50~200mg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r≥0.9986;在線性范圍內(nèi)的添加水平平均回收率為82.7~96.3%,相對標準偏差(RSD)≤5.5%。該方法具有良好的精密度和重現(xiàn)性,適用于蜂蜜中大米糖漿摻假的檢測。

    高效液相色譜;紫外檢測器;蜂蜜摻假;大米糖漿

    蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物結(jié)合后,在巢脾內(nèi)轉(zhuǎn)化、脫水貯存至成熟而成的天然甜物質(zhì)[1-2]。蜂蜜中含有多種活性物質(zhì),其主要成分為果糖和葡萄糖及4~5%的低聚果糖,另外蜂蜜中還含有豐富的氨基酸、維生素、活性酶、類黃酮、多酚類、類胡蘿卜素等活性物質(zhì)及多種礦物質(zhì)[3],蜂蜜既具有極高的營養(yǎng)價值又具有保健作用[4]。我國是養(yǎng)蜂及蜂蜜出口大國,20世紀90年代我國蜂蜜出口量占世界年貿(mào)易量的40%。然而,蜂蜜是一種極易摻假的食品,近年來由于摻假等質(zhì)量問題,使我國蜂蜜產(chǎn)品的信譽越來越低,出口量逐年下降[5]。為了規(guī)范蜂蜜市場,國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、國家標準化委員會于2005年10月26日發(fā)布了GB18796-2005《蜂蜜》國家強制性標準,規(guī)定蜂蜜中不得添加或混入任何淀粉類、糖類、代糖類物質(zhì);不得在蜂蜜中添加其他任何防腐劑、澄清劑、增稠劑等異物。

    目前針對蜂蜜摻假的檢測方法主要有:薄層色譜法[6]、差示掃描熱量法(DSC)[7]、離子色譜法[8]、近紅外光譜法[9-10]、傅里葉轉(zhuǎn)換-拉曼光譜法(FT-Ihman)[11]、C4植物糖含量法[12],13C/12C同位素比值法[13]、天然同位素核磁共振法(SNIF-NMR)[14-16]等。以上方法都是基于對蜂蜜和摻假蜂蜜中糖分的檢測比較,只能對蜂蜜中摻入的蔗糖、高果糖漿、C4植物轉(zhuǎn)化糖等成分進行檢測,而且對試劑、進樣樣品要求較高,樣品前處理步驟要求嚴格,儀器、設備昂貴。大米糖漿主要成分為果糖和葡萄糖,屬于C3植物糖,是由大米淀粉經(jīng)化學和生物方法轉(zhuǎn)化后,再經(jīng)過凈化處理得到的,大米糖漿在糖的組成及同位素比值方面與蜂蜜極為相似。因此以上現(xiàn)行的國家標準和檢測方法很難對其進行鑒別檢測。本研究比較了大米糖漿和蜂蜜中紫外吸收物質(zhì)的差異,發(fā)現(xiàn)了一種大米糖漿中特有的紫外吸收物質(zhì),通過高效液相色譜-紫外檢測法檢測該物質(zhì),能精確的檢測蜂蜜中是否摻有大米糖漿。該方法具有快速、準確、靈敏等特點,并且能降低企業(yè)的檢測成本,易于在蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)普及,指導其生產(chǎn)。

    1 材料與方法

    1.1材料、試劑與儀器

    蜂蜜樣品采自于山東華康蜂業(yè)有限公司合作社蜂場;大米糖漿購自于蕪湖秦氏糖業(yè)有限公司。

    甲醇、乙腈(均為色譜純)天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心;水為超純水。

    LC-10AVP Plus高效液相色譜儀(配有SPD-10AVP紫外檢測器、DGU-20A3在線脫氣機、LC-20ATXL泵、CTO-10ASVP柱溫箱、手動進樣器、LC-Solution數(shù)據(jù)處理軟件)和SHIMADZU AUY220型分析天平日本島津公司;

    756PC紫外可見分光光度計上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

    1.2方法

    1.2.1 HPLC檢測波長的選擇

    準確稱取蜂蜜以及大米糖漿0.5g,分別置于10 ml容量瓶,加去離子水定容至刻度,混勻,超聲溶解30 min,3000 r/min離心5 min,然后取2 ml于石英比色皿內(nèi)進行紫外光譜掃描,以水作空白對照。

    1.2.2大米糖漿標準工作液的配制

    準確稱取適量的大米糖漿,分別用基質(zhì)空白溶液配制成質(zhì)量濃度為5~200mg/ml的標準工作液,以0.45μm微孔濾膜過濾后,準備HPLC分析。

    1.2.3樣品的制備

    準確稱取0.5g蜂蜜樣品,置于10m l容量瓶,加去離子水定容至刻度,混勻,超聲溶解30min。取1ml過預先依次用3m l甲醇、6ml水活化好的C18固相萃取柱,3mL水洗C18柱,棄去流出液。在65kPa的壓力下抽干60min。然后用3ml甲醇洗脫,收集洗脫液于60℃下氮氣吹干,1m l水溶解,渦旋振蕩器振蕩混勻1min,以0.45μm微孔濾膜過濾后,準備HPLC分析。

    1.2.4色譜條件的選擇

    將1.2.2中大米糖漿標準液及1.2.3中蜂蜜樣品以0.45μm微孔濾膜過濾后,進行HPLC分析。色譜條件如下:檢測波長300nm,流速0.80m l/min,柱溫30℃,進樣量100μl。分別考察了Sinochrom ODS-BP柱(250mm× 4.6mm,5μm)、SHIMADZU VP-ODS C18柱(250mm× 4.6mm,5μm),以及不同的流動相對大米糖漿及蜂蜜樣品中紫外吸收物質(zhì)的分離情況,選擇分離度較好的色譜柱和流動相作為分析HPLC流動相條件。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HPLC檢測波長的選擇

    蜂蜜樣品和大米糖漿紫外掃描圖譜1所示,可以看出,蜂蜜樣品和大米糖漿最大吸收均出現(xiàn)在220nm左右,在此波長下對大米糖漿進行檢測可能會受到蜂蜜中基質(zhì)的干擾。同時,大米糖漿在280nm附近也有一吸收峰,而蜂蜜則在260nm附近有一吸收峰。因此,選擇300nm為檢測波長,能夠?qū)Υ竺滋菨{進行檢測,并且能夠減少蜂蜜中基質(zhì)的干擾,以后的試驗也驗證了300nm處檢測靈敏度最高。

    圖1 大米糖漿和蜂蜜樣品紫外掃描圖譜

    2.2樣品凈化條件的選擇

    蜂蜜基質(zhì)比較復雜,對蜂蜜中大米糖漿的檢測造成干擾,因此測定前需對樣品進行凈化處理。試驗對Sep-pak C18、OASIS HLB、OASIS MCX三種固相萃取柱的萃取效率進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在OASIS MCX柱洗脫液中沒有檢測到大米糖漿,OASIS HLB柱和Seppak C18柱對大米糖漿回收率分別為88.6%和86.7%。綜合考慮,本方法選擇Sep-pak C18柱為凈化柱。

    試驗發(fā)現(xiàn),氮氣吹干過程中,在45~80℃范圍內(nèi)溫度與吹干時間成反比,且對大米糖漿中的紫外吸收物質(zhì)的回收率沒有明顯的影響。但是溫度過高容易在氮吹儀的玻璃蓋上形成水滴,綜合考慮,本試驗選擇60℃為濃縮溫度。

    2.3色譜條件的選擇

    試驗中考察了Sinochrom ODS-BP柱(250mm× 4.6mm,5μm)、SHIMADZU VP-ODS C18柱(250mm× 4.6mm,5μm)為分離色譜柱對大米糖漿中紫外吸收物質(zhì)的分離效果。結(jié)果表明,大米糖漿紫外吸收物質(zhì)在Sinochrom ODS-BP柱中能獲得較好的分離。Sinochrom ODS-BP柱填料經(jīng)過技術(shù)改良,增加了在其它C18柱上不保留或者保留較弱的極性化合物和親水性化合物的選擇性,即使在以純水作為流動相的條件下也可以使用,進一步驗證了大米糖漿中的紫外吸收物質(zhì)可能為極性化合物或親水性化合物。所以本試驗選擇Sinochrom ODS-BP柱為該方法的分離色譜柱。

    圖2 水+乙腈=95+5作為流動相時大米糖漿(A)和蜂蜜樣品(B)色譜圖

    考慮到大米糖漿中紫外吸收物質(zhì)可能為親水性化合物,極性較強,因此最初選擇水+乙腈=95+5作為流動相,對大米糖漿和蜂蜜樣品進行分析,色譜圖見圖2。可以看出,大米糖漿在此時間之后出現(xiàn)兩個色譜峰,保留時間分別12.48min、13.57min;蜂蜜樣品在12.48min未檢測到色譜峰,只有保留時間為13.57的一個色譜峰。因此,可以確定保留時間為12.48min色譜峰所代表的組份為大米糖漿特征物質(zhì)。

    由圖2(A)可以看出,保留時間分別為12.48min、13.51min的兩個色譜峰的分離度不好,影響對大米糖漿的準確定量。為改善分離度,試驗增大流動相中有機相的比例,以水+乙腈=93+7作為流動相,對大米糖漿和蜂蜜樣品進行分析,色譜圖見圖3??梢钥闯?,該流動相對大米糖漿中兩種組份有較好的分離,且峰形對稱,可以滿足對大米糖漿定量的要求。

    圖3 水+乙腈=93+7作為流動相時大米糖漿(A)和蜂蜜樣品(B)色譜圖

    2.4線性范圍與檢出限

    將大米糖漿用基質(zhì)空白溶液稀釋成系列質(zhì)量濃度的標準工作液,按上述優(yōu)化好的條件測定,進樣量為100μL,以大米糖漿的質(zhì)量濃度為橫坐標、大米糖漿特征物質(zhì)(RT=9.78min)的峰面積為縱坐標作線性回歸。結(jié)果表明,大米糖漿在50~200mg/g范圍內(nèi)響應值在儀器線性范圍之內(nèi),且線性關(guān)系良好。回歸方程為Y= 53.2245X+7.3541,相關(guān)系數(shù)r=0.9986。

    根據(jù)最終樣品所代表試樣的質(zhì)量、定容體積、進樣量等情況,以S/N>3為原則,確定本方法對大米糖漿的檢出限為20 mg/g。

    2.5方法的回收率與精密度

    用不含大米糖漿的蜂蜜樣品進行添加回收和精密度試驗。蜂蜜樣品中分別添加50 mg/g、100 mg/g、150 mg/g、200 mg/g的大米糖漿,充分震蕩混勻,按照本方法進行凈化及分析,其回收率和精密度見表1。

    表1 方法加標回收率和精密度實驗(%)

    從表1中的回收率和精密度數(shù)據(jù)可以看出,本方法回收率全部數(shù)據(jù)在82.7~96.3%之間,室內(nèi)四個水平的標準偏差≤5.5%,說明方法的回收率和精密度良好,可以滿足對蜂蜜中大米糖漿摻假的檢測要求。

    3 討論

    本方法首先通過紫外光譜掃描獲得大米糖漿中紫外吸收物質(zhì)的吸收波長;然后在此波長下通過HPLC對這些紫外吸收物質(zhì)進行分離,獲得大米糖漿特征物質(zhì)的色譜峰信息;再通過大米糖漿特征物質(zhì)色譜峰對大米糖漿進行定量測定。用該方法檢測蜂蜜中的大米糖漿摻假,方法準確可靠、重復性好、靈敏度高,適用于實驗室日常大批量的樣品檢測。但是本試驗僅獲得大米糖漿特征物質(zhì)的色譜信息,對其組成、結(jié)構(gòu)等信息尚未獲取,今后的試驗將借助LC-MS、NMR等手段對大米糖漿特征物質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)進行分析,以期能更精確的檢測蜂蜜中大米糖漿摻假。

    蜂蜜是一種極易摻假的食品,僅僅通過一種或幾種方法很難做到對其品質(zhì)和真?zhèn)稳娴呐卸?。尤其是近幾年來隨著蜂蜜造假原料越來越精細化、多樣化,造假技術(shù)越來越專業(yè)化,僅靠檢測其中的幾種指標已經(jīng)遠遠不能滿足對其品質(zhì)和真?zhèn)巫龀雠卸ǖ囊?。運用包括同位素分析法、色譜法、光譜法(紅外光譜分析及核磁共振分析)、電化學分析法,針對蜂蜜中某些活性成分的生物分析法(蛋白印跡法、免疫法)以及基于遺傳基因的實時熒光定量PCR法等相結(jié)合,建立多元化的檢測指標,這將是今后蜂蜜品質(zhì)控制的發(fā)展方向。

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    Determination of honey adulteration by addition of rice syrup using HPLC

    Zhang QiAn1Yang Shaobo1Wang Kun2Ding Xiaomin2Lu Demei3
    (1 Shandong Huakang Honey Products Co.,Ltd,Rizhao 276500;2.Shandong Huahan Foods Co.,Ltd, Rizhao 276826;3.Xianyang Jiankang Honey Products Co.,Ltd,Xianyang 713400)

    A reversed-phase high performance liquid chromatographic method for the rapid determination of honey adulteration by addition of rice syrup.The honey sample was dissolved in water and the solution was cleaned with a C18 SPE cartridge.The cartridge was eluted with methanol.The solution was concentrated and then analyzed by HPLC. The HPLC conditions were as follows:Sinochrom ODS-BP column was used with water+acetonitrile=93+7 as the mobile phase,and detection with ultraviolet detector and ration with external standard.The results showed that the detection limit of rice syrup was 20mg/m l.Linear range was 50mg/g~200mg/g.Within its linear,ranger≥0.9986 and the recoveris were between 82.7%and 96.3%,RSD≤5.5%.This method,due to its sensitivity and reliability,has good suitability for determination of honey adulteration by addition of rice syrup.

    high-performance liquid chromatographic;ultraviolet detector;honey adulteration;rice syrup

    張其安(1966-),男,本科,研究方向為蜂產(chǎn)品加工與檢測,E-mail:sdhkfy@126.com。

    楊少波(1978-),男,碩士,研究方向為蜂產(chǎn)品加工與檢測,E-mail:hkhoney@126.com。

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