卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)燙傷休克大鼠腸屏障的保護(hù)作用

趙春香，王瑞剛，張　磊，賀瑞新，馮　凱，張紅梅，李冬梅

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)燙傷休克大鼠腸屏障的保護(hù)作用

趙春香，王瑞剛，張磊，賀瑞新，馮凱，張紅梅，李冬梅

目的：探討卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)燙傷休克大鼠腸屏障的保護(hù)作用。方法：以30%總體表面積Ⅲ度燙傷Wistar大鼠80只為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停S機(jī)分為0.9%氯化鈉注射液對(duì)照組(A組)、膳食纖維治療組(B組)、卡巴膽堿治療組(C組)和膳食纖維+卡巴膽堿治療組(D組)各20只，各組分別在傷后6、12、24、48、72 h處死大鼠4只。另設(shè)正常對(duì)照組(N組，4只)。取小腸在光鏡下觀察各組病理形態(tài)變化，取門(mén)靜脈血測(cè)血漿內(nèi)毒素變化，取腹主動(dòng)脈血測(cè)血漿D-乳酸變化。結(jié)果：各燙傷組大鼠腸組織受損明顯，血漿內(nèi)毒素、D-乳酸水平均明顯高于N組(P<0.01)，傷后12～24 h最顯著，至72 h仍不能恢復(fù)；聯(lián)合應(yīng)用或單用卡巴膽堿與膳食纖維，均可降低大鼠血漿內(nèi)毒素和D-乳酸水平(P<0.05～P<0.01)。結(jié)論：早期聯(lián)用卡巴膽堿與膳食纖維對(duì)燙傷后大鼠腸屏障道有明顯保護(hù)作用，一定程度上優(yōu)于單用卡巴膽堿或膳食纖維的治療效果。

燒傷；卡巴膽堿；內(nèi)毒素；D-乳酸；腸屏障;膳食纖維

胃腸道是人體的主要消化器官，也是最大的細(xì)菌儲(chǔ)存器官，容納細(xì)菌數(shù)量高達(dá)1012個(gè)[1]。正常生理情況下，腸道有著重要的屏障作用，稱(chēng)之為腸屏障，由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障等組成。嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒(燙)傷等可造成腸黏膜屏障的損傷、萎縮，使腸通透性增加，腸菌群失調(diào)，造成腸屏障破壞或功能障礙，從而導(dǎo)致細(xì)菌和/或內(nèi)毒素易位，炎癥因子釋放，并可誘發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙(MODS)[2-3]。隨著相應(yīng)研究和臨床實(shí)踐的深入，腸屏障保護(hù)越來(lái)越受到重視。我們制備30%總體表面積(TBSA)Ⅲ度燙傷大鼠模型，探討卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)腸屏障的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料清潔級(jí)成年雄性Wistar大鼠84只，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量 300 g(±20 g)。復(fù)合膳食纖維購(gòu)于Nutircia(荷蘭)制藥(無(wú)錫)有限公司，不可溶性膳食纖維(耐消化淀粉∶纖維素=1∶1)與可溶性膳食纖維(菊粉∶低聚果糖∶阿拉伯膠=1∶1∶1)比例為3∶1，加水配成200 g/L的液體。卡巴膽堿購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。0.9%氯化鈉注射液購(gòu)于石家莊四藥集團(tuán)。

1.2方法80只大鼠制備30%TBSA Ⅲ度燙傷動(dòng)物模型，隨機(jī)分為0.9%氯化鈉注射液對(duì)照組(A組)、膳食纖維治療組(B組)、卡巴膽堿治療組(C組)和膳食纖維+卡巴膽堿治療組(D組)各20只，各組再分為6、12、24、48、72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各處死4只大鼠，另設(shè)正常對(duì)照組(N組)4只。均于術(shù)前12 h禁食，不禁水。A、B、C、D 4組10%水合氯醛溶液(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，6%硫化鈉脫去大鼠肩部至髖部30%TBSA毛發(fā)[4]，置入97～99 ℃沸水25 s，制備30%TBSA Ⅲ度燙傷大鼠模型[5-6]，傷后立即按Parkland公式補(bǔ)液，24 h總量按每1%TBSA補(bǔ)液4 mL/kg給予，前8 h給予1/2量，剩余1/2量在后16 h以輸液泵勻速泵入。傷后2 h，C、D組大鼠腹腔注射卡巴膽堿30 μg/kg。傷后3 h，A組予0.9%氯化鈉注射液灌胃，B、D組予復(fù)合膳食纖維灌胃，每天125 mg/kg，均勻分6次給予(每4 h 1次)，直至處死。N組大鼠不作處理。期間各組大鼠自由飲水。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1腸道損傷情況取回盲部小腸組織，體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)制片，蘇木精伊紅染色后進(jìn)行組織學(xué)檢查，并對(duì)小腸損傷情況進(jìn)行評(píng)價(jià)[7]：0分，無(wú)異常改變；0.5分，腸黏膜水腫、充血，無(wú)壞死性病變；1分，病變局限，腸黏膜有散在性出血點(diǎn)；2分，壞死累及表淺黏膜，黏膜中有多區(qū)域出血；3分，全層壞死并伴腸腔出血。

1.3.2血漿LPS測(cè)定所用物品均經(jīng)去熱源處理。嚴(yán)格按無(wú)菌操作規(guī)程取門(mén)靜脈血1.5 mL，5 000 r/min離心5 min取上層血清，置入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。按照大鼠血漿LPS ELISA試劑盒(購(gòu)于Bio Swamp公司)使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

1.3.3血漿D-乳酸測(cè)定穿刺腹主動(dòng)脈，取血4～5 mL，5 000 r/min離心5 min，取上層血清，置入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。按照大鼠血漿D-乳酸Elisa試劑盒(購(gòu)于Bio Swamp公司)使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠小腸病理學(xué)標(biāo)本觀察和小腸損傷評(píng)分比較燙傷后，各組大鼠的小腸黏膜出現(xiàn)固有層水腫，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落；腸絨毛橫徑增寬，高度縮短。各燙傷組燙傷后6、12、48和72 h小腸損傷評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各燙傷組燙傷后24 h，A組小腸損傷評(píng)分均高于其他燙傷組(P<0.05)，而B(niǎo)、C和D組小腸損傷評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1　各組大鼠燙傷后小腸損傷評(píng)分比較(ni=4；±s;分)

q檢驗(yàn)：與A組比較*P<0.05

2.2N組和燙傷組大鼠燙傷后不同時(shí)點(diǎn)血漿LPS比較燙傷后6～72 h，各燙傷組大鼠血漿LPS水平均明顯高于N組(P<0.01)。各燙傷組燙傷后6 h和12 h血漿LPS水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各燙傷組燙傷后24 h和48 h血漿LPS水平均低于A組(P<0.05～P<0.01)；B組和C組24 h和72 h血漿LPS水平均高于D組(P<0.05)；C組和D組燙傷后72 h血漿LPS水平均低于A組(P<0.05和P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2　N組和各燙傷組大鼠燙傷后不同時(shí)間LPS水平比較(ni=4；

q檢驗(yàn)：與N組比較**P<0.01；與A組比較 #P<0.05，##P<0.01；與D組比較△P<0.05

2.3N組和燙傷組大鼠燙傷后不同時(shí)點(diǎn)血漿D-乳酸測(cè)定結(jié)果比較燙傷后6、12和72 h，各燙傷組大鼠血漿D-乳酸水平均明顯高于N組(P<0.01)，但各燙傷組大鼠血漿D-乳酸水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組燙傷24 h和48 h后D-乳酸水平均低于A組(P<0.01和P<0.05)，但A、B和C組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組燙傷后24 h血漿D-乳酸水平均明顯低于B組和C組(P<0.01)(見(jiàn)表3)。

表3　N組和各燙傷組大鼠燙傷后不同時(shí)間血漿D-乳酸水平比較(ni=4；±s；μg/L)

q檢驗(yàn)：與N組比較**P<0.01；與A組比較 #P<0.05，##P<0.01；與D組比較△△P<0.01

3　討論

腸缺血-再灌注是燒/燙傷后最常見(jiàn)的病理生理過(guò)程。腸上皮細(xì)胞是腸屏障的重要組成部分，對(duì)缺血、缺氧十分敏感。缺血、缺氧可引起腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的改變，導(dǎo)致腸屏障功能障礙，引起細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位，與膿毒癥和MODS的發(fā)生有密切關(guān)系，是機(jī)體遭受“二次打擊”的來(lái)源[8-9]。如何減輕機(jī)體創(chuàng)傷后腸屏障的損害，減少細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，一直是防治膿毒癥和MODS研究的重要課題。

膳食纖維是指能抗人體小腸消化吸收而能在大腸部分或全部發(fā)酵的可食用植物性成分、碳水化合物及其類(lèi)似物質(zhì)[10-11]。研究[12-16]證實(shí)，膳食纖維是消化過(guò)程中所需要的重要營(yíng)養(yǎng)素，能夠促進(jìn)腸蠕動(dòng)，抑制腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道菌群的生態(tài)平衡，有助于維護(hù)腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，降低腸道通透性，對(duì)腸黏膜有明顯營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。而卡巴膽堿是一種膽堿能受體激動(dòng)藥，能同時(shí)興奮膽堿能M受體和N受體，其興奮M受體可促進(jìn)胃腸動(dòng)力，擴(kuò)張血管；興奮N受體與膽堿能抗炎通路有關(guān)。相關(guān)研究[17-20]表明，卡巴膽堿既能改善腸道微循環(huán)，擴(kuò)張血管增加腸黏膜血流量，又能夠顯著降低腸缺血-再灌注損傷后腸組織炎性反應(yīng)，減少炎癥因子釋放，減輕腸缺血-再灌注時(shí)腸上皮細(xì)胞的損害，從而起到保護(hù)腸屏障功能。

我們以30%TBSA Ⅲ度燙傷Wistar大鼠為動(dòng)物模型，研究燒傷早期聯(lián)合應(yīng)用復(fù)合膳食纖維與卡巴膽堿對(duì)腸屏障的保護(hù)作用，并與單獨(dú)應(yīng)用卡巴膽堿或膳食纖維時(shí)相比較。目前有多種檢測(cè)腸屏障損傷的指標(biāo)，本研究中我們選擇的是光鏡下的腸結(jié)構(gòu)變化和血漿LPS、D-乳酸水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，燙傷后24 h，B、C和D組小腸損傷評(píng)分均低于A組(P<0.05)。燙傷后24 h和48 h，B、C和D組血漿LPS水平均低于A組(P<0.05～P<0.01)；燙傷后24 h和72 h，D組血漿LPS水平均低于B組和C組(P<0.05)；燙傷后72 h，C組和D組血漿LPS水平均低于A組(P<0.05和P<0.01)。燙傷后24 h和48 h D組D-乳酸水平均低于A組(P<0.01和P<0.05)，但A、B和C組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；燙傷后24 h，D組血漿D-乳酸水平均明顯低于B組和C組(P<0.01)。提示單用或者聯(lián)合應(yīng)用卡巴膽堿和膳食纖維均對(duì)腸屏障有明顯保護(hù)作用，且聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腸道的保護(hù)要優(yōu)于單用。

綜上，聯(lián)合應(yīng)用卡巴膽堿與膳食纖維對(duì)燙傷后大鼠腸屏障道有保護(hù)作用，啟動(dòng)時(shí)間較早，一定程度上優(yōu)于單用卡巴膽堿或膳食纖維。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有與本研究相似的研究報(bào)道，但本研究?jī)H是初步研究，樣本量較小，仍需進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究。

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(本文編輯盧玉清)

The protective effect of carbachol combined with dietary fiber on the intestinal barrier in rats with burn shock

ZHAO Chun-xiang,WANG Rui-gang,ZHANG Lei,HE Rui-xin,FENG Kai,ZHANG Hong-mei,LI Dong-mei

(DepartmentofNICU,TheAffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofTechnology,TangshanHebei063000,China)

Objective:To explore the protective effects of carbachol combined with dietary fiber on the intestinal barrier in rats with burn shock.Methods:The animal model of 80 Wistar rats with 30% TBSA Ⅲ° burn were established,and randomly divided into the saline injection group(group A),dietary fiber treatment group(B group),carlbachol treatment group(groupC) and carlbachol combined with dietary fiber treatment group(group D)(20 rats each group).The 4 rats in each group were sacrificed at 6，12，24，48 and 72 hours after injury,respetcively.The 4 normal rats were set as the control group(group N).The pathomorphological change of small intestine was observed under light microscope,the plasma levels of endotoxin in portal vein and D-lactic acid in abdominal aorta were detected.Results:The damage of the intestinal tissue in each burn group was significant.The plasma levels of endotoxin and D-lactic acid in all burn rats were significantly higher than those in group N,which arrived at peak at 12 to 24 hours after injury,and did not recover until 72 hours after injury.The treatment of the carlbachol combined with dietary fiber of single carlbachol or dietary fiber could significantly decrease the levels of the plasma endotoxin and D-lactic acid(P<0.05 toP<0.01).Conclusions:The early application of carlbachol combined with dietary fiber has markedly protective effect on intestinal barrier in burn rats,the treatment effect of which is better than that in single treatment of carbachol or dietary fiber to some exent.

burn;carbachol;endotoxin;D-lactic acid;intestinal barrier；dietary fiber

2014-12-17

河北省衛(wèi)計(jì)委指令性課題(ZL20140187)

單位] 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 NICU，河北 唐山 063000

[作者簡(jiǎn)介] 趙春香(1976-)，女，碩士，主管護(hù)師.

王瑞剛，主任醫(yī)師，副教授.E-mail：18632511199@163.com

1000-2200(2016)05-0563-04

R 644

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.05.002