橙皮多糖組成、理化性質(zhì)及抗氧化性檢測*

喬立龍，程翠利，周春姣，王輝憲，蔣紅梅

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南　長沙　410128)

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橙皮多糖組成、理化性質(zhì)及抗氧化性檢測*

喬立龍，程翠利，周春姣，王輝憲，蔣紅梅

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙410128)

探索并優(yōu)化了橙皮多糖的提取工藝條件，檢測純化后橙皮多糖的組成，理化性質(zhì)及抗氧化性；方法：采用用單因素及正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探索并優(yōu)化超聲波輔助提取橙皮多糖的工藝條件，粗多糖經(jīng)氯仿:正丁醇(5:1，V:V)去蛋白、濃縮、乙醇沉淀后冷凍干燥，利用離子色譜技術(shù)分析純化后橙皮多糖的組成，采用常規(guī)理化檢測方法及體外抗氧化實(shí)驗(yàn)檢測了純化后橙皮多糖的理化性質(zhì)及抗氧化性能力。結(jié)果表明離子色譜法測得橙皮多糖由3種單糖組成，分別為鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸；理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，橙皮多糖溶于水，微溶于體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，不溶于乙醚、丙酮，灰分含量為0.1191%，蛋白質(zhì)含量為0.15 mg/g抗氧化能力低于抗壞血酸(Vc)和2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)，橙皮粗多糖抗氧化能力優(yōu)于精制橙皮多糖。

多糖；橙皮；組成；理化性質(zhì)；抗氧化能力

陳皮，為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，是傳統(tǒng)中藥材。具有理氣健脾，調(diào)中，燥濕，化痰等功效。在《本草綱目》、《日用本草》中均有記載。橙皮中富含豐富的色素、苷類、果膠、纖維、香精油、礦物質(zhì)、多糖。目前, 國內(nèi)外對(duì)柑、橘、橙、柚等同類果實(shí)果皮的利用主要體現(xiàn)在藥品、食品及化妝品的香精油、色素、果膠、苷類的提取[1-5]。

多糖即多聚糖(Polysaccharide)一般是指由十個(gè)或十個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵聚合而成的一種生物大分子，其分子量可以從幾千到數(shù)百萬[6-9]。多糖不僅是生物體的重要營養(yǎng)物質(zhì)，而且在生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10]，廣泛分布于生物界特別是植物界[11-12]。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn),從植物中提取的多糖擁有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤以及降血脂、抗氧化、抗病毒等生物活性[13-17]。利用植物多糖的生物活性，將具有廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)以水作為提取劑提取橙皮多糖，分析了橙皮多糖的組成，理化性質(zhì)及抗氧化性研究。為橙皮多糖的開發(fā)與利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

臍橙(Citrus sinensis Osbeck)，湖南永州。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，中國食品藥品檢定研究院；抗壞血酸(AR)，中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(AR)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；三吡啶基三嗪(AR)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(AR)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器；SHIMADZU UV-2450型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津； SB25-12DT超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技；DIONEX ICS-900離子色譜儀，美國戴安；DIONEX PAD-2 脈沖安培檢測器，美國戴安；METROSEP CARB(150 mm×4.0 mm)陰離子交換柱，瑞士萬通。

1.2方法

1.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密稱取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，定容至100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取0.1 g/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.0 mL, 0.2 mL, 0.4 mL, 0.6 mL, 0.8 mL, 1.0 mL，1.2 mL于10 mL具塞試管中，補(bǔ)加蒸餾水至2 mL，分別加入5%苯酚溶液1 mL，混合均勻后快速加入濃硫酸5.0 mL，即刻搖勻，室溫靜置20 min，在波長200～800 nm之間掃描，確定最佳吸收波長為490 nm，在此波長處測定吸光度，得回歸方程：A=0.0438C+0.0054，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。A為吸光度，C為葡萄糖濃度。

1.2.2橙皮多糖的提取和含量測定流程

新鮮臍橙皮→干燥→粉碎→干粉→蒸餾水→超聲→定容→離心→取上層清液(濃縮可得橙皮粗多糖)→同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟測定吸光度→根據(jù)回歸方程計(jì)算含量

提取液中多糖質(zhì)量(以葡萄糖當(dāng)量計(jì)算)=c×V×稀釋倍數(shù)

式中：c——標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖濃度，mg/mL

V——橙皮多糖提取液體積，mL

1.2.3橙皮多糖提取條件優(yōu)化

稱取1 g橙皮粉末，通過超聲波輔助法進(jìn)行橙皮多糖的提取，固定液固比45:1，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間30 min，提取一次。分別考察液固比、超聲溫度、超聲時(shí)間對(duì)橙皮多糖提取率的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)表，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化橙皮多糖的提取工藝。

1.2.4橙皮多糖的純化

橙皮多糖提取液→Sevage法[18]除蛋白→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀24 h→離心→沉淀→丙酮、乙醚洗滌抽濾→真空冷凍干燥→精制橙皮多糖

1.2.5離子色譜法測定橙皮多糖的單糖組成

準(zhǔn)確稱取精制橙皮多糖51.0 mg于100 mL容量瓶中，用1 mol/L醋酸水溶液定容至100 mL，超聲6 h。多糖水解液經(jīng)C18柱過濾，濾液轉(zhuǎn)入樣品管中，進(jìn)行離子色譜單糖檢測分析。

檢測條件：儀器型號(hào)：ICS-900；檢測器：脈沖安培檢測器；METROSEP CARB(150 mm×4.0 mm)陰離子交換柱；進(jìn)樣體積10.0 mL；淋洗液：6.0 mmol/L NaOH；流速：1.0 mL/min，柱溫：32 ℃；再生液：200 mmol/L NaOH；分析時(shí)間為60 min。

1.2.6橙皮多糖理化性質(zhì)的研究

橙皮多糖溶解性及其水溶液pH值實(shí)驗(yàn)：提取的粗多糖經(jīng)純化后，觀察其顏色、狀態(tài)、氣味；取等量純化后多糖分別溶于水、乙醇、乙醚、丙酮，觀察溶解情況。取一定量純化后橙皮多糖水溶液測定pH值。

灰分含量的測定：用灼燒至恒重的坩堝稱取經(jīng)P2O5干燥至恒重的純化后橙皮多糖樣品50～100 mg(精確至0.0002 g)，置馬弗爐于740 ℃下灼燒12 h，燒至恒重為止，冷卻至室溫，稱重。

水溶液特性黏數(shù)測定：根據(jù)《黏度測定法 中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范2010版》中第三種方法測定特性黏數(shù)。

蛋白質(zhì)含量測定：參照文獻(xiàn)[19]的方法，測定純化后橙皮多糖中蛋白質(zhì)的含量。

糖醛酸檢測：糖醛酸與咔唑反應(yīng)生成紫紅色化合物，用硫酸-咔唑反應(yīng)可以鑒別有無糖醛酸。試劑配制：稱取咔唑0.125 g 溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇中，置于棕色試劑瓶中4 ℃保存。測量步驟如下：將質(zhì)量濃度為12 mg/mL的純化后橙皮多糖水溶液2.0 mL緩慢加入盛有12.0 mL濃硫酸的大試管中，然后在沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，加入上述咔唑乙醇溶液0.4 mL，充分混勻，室溫下放置30 min，觀察有無紫紅色化合物生成。

淀粉檢測：利用稀釋的碘-碘化鉀溶液與淀粉作用時(shí)，形成碘化淀粉，呈藍(lán)色的特殊反應(yīng)，可以用來鑒定有無淀粉。所需試劑為碘化鉀3 g，蒸餾水100 mL，碘1 g。先將碘化鉀溶于蒸餾水中，待全部溶解后再加碘，振蕩溶解。取1.0 mg/mL的橙皮多糖溶液1.0 mL，加入碘-碘化鉀試劑2滴，觀察顏色變化。以蒸餾水為陰性對(duì)照，1.0 mg/mL 淀粉溶液為陽性對(duì)照。

1.2.7橙皮多糖抗氧化能力測定

2　結(jié)果與分析

2.1超聲波輔助法提取橙皮中多糖的提取工藝優(yōu)化

圖1　固液化、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)萃取劑產(chǎn)量的影響

考察不同料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度等因素對(duì)橙皮多糖得率的影響見圖1?？梢钥闯?，超聲溫度為60 ℃時(shí)，橙皮粗多糖得率達(dá)到最大值，隨后隨溫度的升高提取率反而下降，這可能是因?yàn)檫^高的溫度導(dǎo)致了部分多糖的分解或與其它雜質(zhì)發(fā)生了反應(yīng)。料液比對(duì)橙皮多糖得率有明顯的影響，當(dāng)料液比達(dá)到 1:45時(shí)，橙皮多糖得率達(dá)到最大值。超聲時(shí)間比對(duì)橙皮粗多糖得率的影響較小，當(dāng)時(shí)間從 10 min增加到20 min時(shí)，多糖得率升高，之后隨著時(shí)間的增加，多糖得率趨于平穩(wěn)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)表，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1。正交實(shí)驗(yàn)的極差分析結(jié)果表明：橙皮多糖提取率的影響因素為料液比>超聲溫度>超聲時(shí)間。料液比為1:15，時(shí)間為20 min，溫度為70 ℃為最佳提取工藝，此時(shí)橙皮多糖的得率為6.32%。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性，設(shè)計(jì)最佳工藝的平行實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性可靠。

表1　正交試驗(yàn)

2.2離子色譜法檢測橙皮多糖的單糖組成

按1.3.5方法對(duì)純化后橙皮多糖進(jìn)行處理，用離子色譜法檢測橙皮多糖分子中的單糖組成。檢測結(jié)果見圖2。 由圖2可以看出，橙皮多糖主要由三種單糖組成，即鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸，半乳糖醛酸含量53.909 mg/g最多，只含少量的鼠李糖、葡萄糖。

表2　橙皮多糖的離子色譜

2.3橙皮多糖理化性質(zhì)檢測結(jié)果

按1.3.6方法對(duì)純化后橙皮多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果顯示：橙皮多糖溶于水，微溶于95%乙醇，不溶于乙醚、丙酮；其溶液的pH值為5.83；灰分含量為0.1191%；蛋白質(zhì)含量為0.15 mg/g；硫酸-咔唑反應(yīng)有紫紅色化合物生成，說明精制橙皮多糖里面含有較多的糖醛酸；碘-碘化鉀反應(yīng)顏色深于陰性對(duì)照淺于陽性對(duì)照，說明其淀粉含量很低。

2.4橙皮多糖抗氧化能力測定結(jié)果

圖3　樣品的抗氧化能力

3　討　論

離子色譜法結(jié)果表明：橙皮多糖主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸三種單糖組成。橙皮多糖的硫酸-咔唑反應(yīng)有紫紅色化合物生成，進(jìn)一步證實(shí)橙皮多糖里面含有較多的半乳糖醛酸；已有研究表明，半乳糖醛酸對(duì)癌細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，如糖聚合度為5的β-(1→4)-半乳寡糖醛酸(AOG)具有顯著預(yù)防實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎癌變(93.5%)的功能[23]，半乳糖醛酸增加改性后的甘薯果膠對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、乳腺癌細(xì)胞Bcap-37增殖具有明顯的抑制作用[24]。橙皮多糖是否同樣具有抗癌細(xì)胞增殖能力還有待進(jìn)一步證實(shí)，此外，橙皮多糖中單糖之間的連接方式、連接位置、分子量等信息仍不完整，還有待進(jìn)一步深入細(xì)致的研究。

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Determination of the Monosaccharide Components, Physicochemical Property and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Orange Peel*

QIAO Li-long, CHENG Cui-li, ZHOU Chun-jiao, WANG Hui-xian, JIANG Hong-mei

(College of science, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128, China)

polysaccharides; orange peel; composition; physicochemical property; antioxidant capacity

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014WK3011);湖南省教育廳項(xiàng)目(10C0816)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)基金項(xiàng)目(109WD16)；大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(DFCXY201219)；湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司合作項(xiàng)目。

O629.12

A

1001-9677(2016)01-0125-04