長鏈非編碼RNA GAS5對人乳腺癌細(xì)胞株增殖和侵襲能力的影響

吳海華，李　鈺,張凌宇,王海鳳，陳　麗,黃文明,陳素蓮,陳昌杰,楊清玲

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

長鏈非編碼RNA GAS5對人乳腺癌細(xì)胞株增殖和侵襲能力的影響

吳海華1，李鈺1,張凌宇1,王海鳳1，陳麗2,黃文明2,陳素蓮3,陳昌杰3,楊清玲3

目的：探討長鏈非編碼RNA GAS5對人乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移生物學(xué)活性的影響。方法：qRT-PCR方法檢測3株乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3、 MDA-MB-231及MCF-7中LncRNA GAS5的表達(dá)；LncRNA GAS5干擾片段和過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染LncRNA GAS5高表達(dá)以及低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株，qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后LncRNA GAS5的表達(dá)；磺酰羅丹明B染色法檢測細(xì)胞的增殖能力；Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲及遷移能力。結(jié)果：LncRNA GAS5在乳腺癌SKBR-3細(xì)胞中表達(dá)量最低，MCF-7細(xì)胞中表達(dá)量最高(P<0.01)；SKBR-3以及MCF-7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染LncRNA GAS5過表達(dá)載體和干擾片段后，SKBR-3細(xì)胞LncRNA GAS5表達(dá)量增高，MCF-7表達(dá)量降低(P<0.01)；下調(diào)LncRNA GAS5的表達(dá)，細(xì)胞的增殖能力升高，侵襲及遷移能力增強(qiáng)(P<0.01)；過表達(dá)LncRNA GAS5之后，細(xì)胞的增殖能力、侵襲和遷移能力減弱(P<0.01)。結(jié)論：LncRNA GAS5是涉及到乳腺癌發(fā)展的一個(gè)新型的分子，有可能成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

乳腺腫瘤；長鏈非編碼RNA；GAS5；增殖；遷移；侵襲

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年美國有232 670例新確診的乳腺癌病例，有40 000例患者死于乳腺癌[1]。盡管目前對乳腺癌的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但仍有高達(dá)30%的患者在接受正規(guī)的治療后死于乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]，因此對其轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行研究就顯得尤為重要。長鏈非編碼RNAs(the Long Non-Coding RNAs,LncRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt且不編碼蛋白的RNA分子。最近研究[3-4]發(fā)現(xiàn)LncRNAs在癌癥的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程。LncRNA GAS5最初是通過消減雜交的方法從NIH 3T3細(xì)胞中分離出來，目前越來越多的研究[5-7]發(fā)現(xiàn)LncRNA GAS5在許多癌癥中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用，如LncRNA GAS5在前列腺癌、腎細(xì)胞癌以及乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)充當(dāng)著抑癌基因的角色，而在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)發(fā)揮著癌基因的作用[8]。已有報(bào)道[9]稱LncRNA GAS5在調(diào)控細(xì)胞的周期及凋亡方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用，但對其在調(diào)控細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移方面的研究較少。本研究就LncRNA GAS5對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響作一探討。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SKBR-3和MDA-MB-231購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清購自Hlyclone公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和G418購自Gibco公司； Trizol試劑和Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；LncRNA GAS5干擾片段及過表達(dá)載體購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自AXYGEN公司；所有引物合成和DNA序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌SKBR-3、MDA-MB-231以及MCF-7細(xì)胞株均購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2～3 d傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2qRT-PCR檢測LncRNA GAS5的表達(dá)情況Trizol法提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。GAPDH作為內(nèi)參，所用的引物序列見表1。

表1　引物序列

1.2.3轉(zhuǎn)染LncRNA GAS5干擾片段和過表達(dá)載體取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，離心，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液種于6孔板中，使第2天細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%。將5 μL濃度為20 μmol/L的LncRNA GAS5干擾片段(或4 μg含LncRNA GAS5全基因的質(zhì)粒)稀釋于250 μL無血清培養(yǎng)基中，5 μL Lipofectamine 2000(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒需10 μL Lipofectamine 2000)稀釋于250 μL無血清培養(yǎng)基中，室溫靜置5 min。將稀釋好的干擾片段或質(zhì)粒與Lipofectamine 2000混勻，室溫靜置20 min。在6孔板中每孔加入無血清培養(yǎng)基1.5 mL，將轉(zhuǎn)染混合物緩慢加入6孔板中，6 h以后換成含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。LncRNA GAS5干擾片段序列為：5′-UCC UAA AGA GCA AGC CUA AT-3′;5′-UUA GGC UUG CUC UUU AGC ATT-3′。

1.2.4磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色法檢測細(xì)胞的增殖活性取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，離心，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液種于96孔板中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁生長；對細(xì)胞進(jìn)行加藥處理后24 h、48 h、72 h分別終止培養(yǎng)，吸出培養(yǎng)液并且每孔加入200 μL 10%三氯乙酸(TCA)，4 ℃，固定50 min；用雙蒸水洗滌5遍，室溫下晾干；每孔加入100 μL 0.4% SRB染液，染色30 min；棄染液，用1%乙酸溶液輕輕洗滌5遍，室溫下晾干；每孔加入150 μL 10 mmol/L Trisbase溶液，搖床上劇烈振蕩15 min，使SRB充分溶解,最后用酶標(biāo)儀檢測波長515 nm處的吸光度值。抑制率={(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-陰性對照組吸光度值)/陰性對照吸光度值}×100%。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，離心將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液種于6孔板中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%～90%時(shí)，用10 μL無菌槍頭相同力度在細(xì)胞板中間輕輕劃出一道傷口，注意保持各組劃出傷口寬度基本一致，用PBS洗滌2次，對細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的加藥處理。分別于加藥培養(yǎng)后0、48 h在低倍鏡下測量各組細(xì)胞任意3個(gè)部位的不同傷口的寬度。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基將每組的細(xì)胞調(diào)整到相同細(xì)胞密度。按照實(shí)驗(yàn)分組，每組各取100 μL加入Transwell小室的上室。Transwell小室的下室加入600 μL 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽小心擦去Transwell小室上室的培養(yǎng)基以及膜上部未穿過的細(xì)胞，4%多聚甲醇固定20 min，吉姆薩染液染色，拍照觀察高倍鏡下穿過的細(xì)胞數(shù)目。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析和q檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3、MDA-MB-231和MCF-7中LncRNA GAS5表達(dá)水平比較qRT-PCR結(jié)果顯示：3株乳腺癌細(xì)胞SKBR-3、MDA-MB-231和MCF-7均可表達(dá)LncRNA GAS5，但LncRNA GAS5在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)量最高，在SKBR-3細(xì)胞中表達(dá)量最低，各株細(xì)胞間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選用MCF-7細(xì)胞做LncRNA GAS5的干擾實(shí)驗(yàn)，用SKBR-3細(xì)胞構(gòu)建LncRNA GAS5高表達(dá)細(xì)胞株。

q檢驗(yàn)：與SKBR-3組比較*P<0.05,**P<0.01;與MDA-MB-231組比較△△P<0.01

2.2si-GAS5明顯降低LncRNA GAS5在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)為了進(jìn)一步研究LncRNA GAS5在人類乳腺癌中的作用，LncRNA GAS5特異性的siRNA(si-GAS5)被轉(zhuǎn)入到MCf-7細(xì)胞中，非特異性的siRNA作為陰性對照(si-NC)。與si-NC組比較，si-GAS5組LncRNA GAS5的表達(dá)量明顯降低(P<0.01)(見表3)。

表3　si-GAS5對MCF-7細(xì)胞LncRNA GAS5表達(dá)的影響

2.3pcDNA-GAS5對SKBR-3細(xì)胞LncRNA GAS5表達(dá)的影響為了評估LncRNA GAS5在人乳腺癌細(xì)胞中的作用，pcDNA-GAS5載體被轉(zhuǎn)入到SKBR-3細(xì)胞中，以空載體組作為對照。與空載體組比較，pcDNA-GAS5載體組LncRNA GAS5的表達(dá)量升高，并以pcDNA-GAS5-2升高較明顯(P<0.01)(見表4)。

q檢驗(yàn)：與pcDNA-NC組比較**P<0.01;與pcDNA-GAS5-1組比較△△P<0.01

2.4LncRNA GAS5對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響為探討LncRNA GAS5在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，采用SRB實(shí)驗(yàn)對LncRNA GAS5對乳腺癌細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，與si-NC轉(zhuǎn)染組比較，si-GAS5轉(zhuǎn)染組明顯促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖(P<0.01)(見表5)，24、 48、72 h的增殖誘導(dǎo)率分別為40.3%、13.2%以及8.8%；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-GAS5組明顯抑制細(xì)胞的增殖(P<0.01)(見表6)，24、48、72 h的增殖抑制率分別為9.1%、15.2%、12.3%。

表5　si-GAS5對MCF-7細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用

表6　pcDNA-GAS5對SKBR-3細(xì)胞的增殖抑制作用

2.5LncRNA GAS5對乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)研究了LncRNA GAS5對乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的調(diào)控作用。與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-GAS5轉(zhuǎn)染組的遷移率明顯上調(diào)(見圖1A)，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-GAS5轉(zhuǎn)染組侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)(見表7，圖1B)。而在乳腺癌SKBR-3細(xì)胞中上調(diào)LncRNA GAS5的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，相對于pcDNA-NC轉(zhuǎn)染組，pcDNA-GAS5轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的侵襲及遷移能力明顯降低(P<0.01)(見圖1C、1D、表8)。

表7　si-GAS5 對MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響

表8　pcDNA-GAS5對SKBR-3細(xì)胞遷移能力的影響

3　討論

隨著人們對LncRNA的不斷認(rèn)識，越來越多的研究[10]表明腫瘤形成的分子機(jī)制不僅與蛋白編碼基因有關(guān),而且與許多的LncRNA有關(guān)。雖然目前一些LncRNAs已經(jīng)被證明在腫瘤的形成及發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，但是僅有一小部分的LncRNAs被研究，仍有許多重要的問題需要解決。本課題主要研究LncRNA GAS5 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

LncRNA GAS5是一個(gè)長度為650 bp的LncRNA，由1q25基因編碼，這個(gè)基因座位與淋巴瘤高度相關(guān)[11]。LncRNA GAS5在許多腫瘤中充當(dāng)著抑癌基因的角色，調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。QIN等[12]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA GAS5在腎細(xì)胞癌中的低表達(dá)與腎細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，并且LncRNA GAS5的高表達(dá)對腎細(xì)胞癌起到抑制的作用；TU等[13]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA GAS5在多數(shù)肝癌病人組織中低表達(dá)，并且LncRNA GAS5的表達(dá)是肝癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。還有研究[8]發(fā)現(xiàn)LncRNA GAS5在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)，通過間接調(diào)控miR-21參與骨肉瘤細(xì)胞的凋亡和自噬過程。雖然目前關(guān)于LncRNA GAS5的研究已有很多，但有關(guān)LncRNA GAS5在乳腺癌中作用的研究較少。

LncRNA GAS5可以通過多種不同的方式對腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)行調(diào)控。有報(bào)道[14]稱LncRNA GAS5可以與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子eIF4E以及c-myc mRNA共同作用調(diào)控c-myc的翻譯，進(jìn)而促進(jìn)胚胎的發(fā)育以及腫瘤的形成；LIU等[15]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA GAS5可以與轉(zhuǎn)錄激活因子YBX1相互作用，下調(diào)LncRNA GAS5的表達(dá)降低YBX1蛋白水平，繼而降低p21的表達(dá)，減少對細(xì)胞周期的阻斷作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖；還有大量的研究[16-18]報(bào)道稱LncRNA GAS5通過負(fù)向調(diào)控CDK6的表達(dá)進(jìn)而抑制前列腺癌、膀胱癌以及胃癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。另外還有文獻(xiàn)[10，19]報(bào)道了LncRNA GAS5與腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，但在乳腺癌中LncRNA GAS5與細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系仍未見報(bào)道。

為了進(jìn)一步闡明LncRNA GAS5在乳腺癌發(fā)展中的作用機(jī)制，本研究比較了3株乳腺癌細(xì)胞株中LncRNA GAS5的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA GAS5在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)量最高，在SKBR-3細(xì)胞中表達(dá)量最低，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中用MCF-7細(xì)胞做LncRNA GAS5干擾試驗(yàn)，用SKBR-3細(xì)胞過表達(dá)LncRNA GAS5來進(jìn)行研究。在MCf-7細(xì)胞中下調(diào)LncRNA GAS5的表達(dá)，可以明顯地促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，增加乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力。相反，在SKBR-3細(xì)胞中上調(diào)LncRNA GAS5的表達(dá)，可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力，表明LncRNA GAS5可以影響乳腺癌細(xì)胞發(fā)生及發(fā)展過程。這些結(jié)果表明LncRNA GAS5在乳腺癌細(xì)胞中可能是作為一個(gè)腫瘤抑制基因，它的缺乏或者表達(dá)降低都可能導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。

綜上，下調(diào)LncRNA GAS5的表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。LncRNA GAS5是涉及到乳腺癌發(fā)展的一個(gè)新型的分子，有可能成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

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(本文編輯姚仁斌)

The effect of LncRNA GAS5 on prolification,migration and invation in breast cancer cells

WU Hai-hua1,LI Yu1,ZHANG Ling-yu1,WANG Hai-feng1,CHEN Li2,HUANG Wen-ming2,CHEN Su-lian3,CHEN Chang-jie3,YANG Qing-ling3

(1.ClinicalTestingandDiagnoseExperimentalCenter，2.DepartmenofBioscience，3.DepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030,China)

Objective:To investigate the effect of LncRNA GAS5 on prolification,migration and invation in breast cancer cells.Methods:To achieve our goal,we used qRT-PCR assay to detect the expression of LncRNA GAS5 in breast cancer SKBR-3,MDA-MB-231 and MCF-7 cells;SRB assay was used to measure the prolification ability of breast cancer cells;Wound healing and Transwell assay was used to dentect the ability of invation and migration in breast cancer cells.Results:Among the three breast cancer cell lines,the expression level of LncRNA GAS5 in SKBR-3 cell is lowest and the expression level of LncRNA GAS5 in MCF-7 cell is highest(P<0.01).After transfected MCF-7 or SKBR-3 cells with si-GAS5 or pcDNA-GAS5-vertor,the expression level of LncRNA GAS5 in MCF-7 cells is down-regulated and in SKBR-3 cells is up-regulated(P<0.01),depletion of LncRNA GAS5,the prolification,invation and migration ability of MCF-7 cells is increased(P<0.01).Overexpression of LncRNA GAS5 made the prolification,invation and migration ability of SKBR-3 cells decreased(P<0.01).Conclusions:lncRNA GAS5 is a novel molecule involved in breast cancer progression,which provide a potential therapeutic target.

breast neoplasms;the long non-coding RNA;GAS5;prolification;invation;migration

2016-05-05

安徽省教育廳自然科學(xué)重大項(xiàng)目(KJ2015ZD29，KJ2016SD37)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1508085MH159)；安徽省高校學(xué)科(專業(yè))拔尖人才學(xué)術(shù)資助重點(diǎn)項(xiàng)目(gxbjZD2016069)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201410367023)；蚌埠醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201510367022);蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(Byycx1524)

單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院1.臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,2.生物科學(xué)系,3.生物化學(xué)教研室,安徽 蚌埠 233030

[作者簡介] 吳海華(1989-)，女，碩士研究生.

楊清玲，碩士，碩士研究生導(dǎo)師，教授.E-mail：yqlmimi@163.com

1000-2200(2016)07-0849-05

R 737.9

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.07.003