異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的分離純化及其酶性質(zhì)

徐 　 丹，　金 鳳 燮，　魚 紅 閃

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的分離純化及其酶性質(zhì)

徐 丹，金 鳳 燮，魚 紅 閃

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

采用分子篩及離子交換法對(duì)微生物Absidiasp.R42g所產(chǎn)異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明,異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量為62 ku，最適溫度為40 ℃，最適pH為5.0。在50 ℃以下，pH 4.0～6.0，相對(duì)酶活力較穩(wěn)定，Na+、K+、Ca2+3種金屬離子對(duì)相對(duì)酶活力無影響；而在Fe3+、Cu2+兩種金屬離子存在的情況下，相對(duì)酶活力為零；酶反應(yīng)結(jié)果顯示該酶的最大反應(yīng)速度和米氏常數(shù)分別為6.711 mmol/(L·h) 和18.89 mmol/L。

異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶；分離純化；酶性質(zhì)

0　引　言

異槲皮苷(Isoquercitrin)為黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、降壓等生物活性[1]。異槲皮苷的3-C位水解掉葡萄糖基，成為槲皮素(quercetin)，該類化合物及其衍生物同屬于類黃酮化合物，在果蔬及中草藥中大量存在。槲皮素具有廣泛的生物活性，不僅對(duì)癌癥有化學(xué)預(yù)防作用，還具有抗癌和抗突變等多種生理功能。近期研究還發(fā)現(xiàn)它是強(qiáng)有力的腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑。人體對(duì)槲皮素的不良反應(yīng)表現(xiàn)不明顯，所以具有良好的開發(fā)前景和藥用價(jià)值[2]。本實(shí)驗(yàn)研究了利用酶水解法由異槲皮苷制備槲皮素所需的酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了探討。

1　材料與方法

1.1材料

液體培養(yǎng)基：12%的槐花浸出液中加入48%的麥芽汁，糖度為5°；菌種：Absidiasp.R42g，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2方法

1.2.1酶蛋白的分離純化

1.2.1.1粗酶液的分離

將菌種接種于經(jīng)過高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵3～5 d。

將發(fā)酵液離心，取上清，加入硫酸銨至飽和度75%，4 ℃靜止過夜。離心去除上清，收集沉淀。用pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解，并在該緩沖體系中透析2 d，離心收集上清即為所需粗酶液。

1.2.1.2層析分離

葡聚糖凝膠層析法對(duì)酶進(jìn)行初步分離，用緩沖液作洗脫劑，洗脫液體積流量0.5 mL/min，每10 min收集一管。采用TLC法進(jìn)行酶活檢測(cè)，確定酶活較高的收集管，合并酶液進(jìn)行離子交換層析。離子交換層析法對(duì)酶進(jìn)行再次分離，將8 mL 收集的酶液上柱后，先用緩沖液洗脫，再分別以0.02 mol/L pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液配制的60、120、150、180、210、240、300 mmol/L KCl溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相體積流量為1 mL/min，分離提純蛋白質(zhì)。洗脫液在280 nm下測(cè)定OD，并通過蛋白質(zhì)色譜儀繪出吸收?qǐng)D譜。

1.2.2酶活力的測(cè)定

薄層層析法測(cè)定酶活力，展開劑為體積比10∶7∶1∶1的乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水混合液，標(biāo)準(zhǔn)品為用0.02 mol/L pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液配制的2.0 mg/mL異槲皮苷溶液。取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)品底物溶液，加入等體積的酶液，在40 ℃下恒溫反應(yīng)14 h，加入反應(yīng)液等體積的水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)，取上層液作TLC檢測(cè)，計(jì)算酶活力。

1.2.3酶的純度及分子質(zhì)量測(cè)定

采用SDS-PAGE測(cè)定酶蛋白的分子質(zhì)量，根據(jù)異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的相對(duì)遷移率計(jì)算分子質(zhì)量。

1.2.4蛋白含量測(cè)定

用Folin-酚法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.5酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

采用“1.2.2”中酶活力的測(cè)定方法測(cè)定提純酶的最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、金屬離子對(duì)酶活力的影響[5-7]。

2　結(jié)果與討論

2.1酶的分離純化

各純化步驟的結(jié)果如表1所示。由表1可知，粗酶液經(jīng)過分離純化后比活達(dá)到2.8 U/mg，提純倍數(shù)達(dá)到12.17，收率為1.15%。分離純化所得異槲皮苷葡萄糖苷酶經(jīng)SDS-PAGE鑒定，提純酶電泳結(jié)果為單帶，結(jié)果如圖1所示。

根據(jù)圖1中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率與分子量的對(duì)數(shù)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程：y=2.073-1.023x，R2=0.993。將異槲皮苷葡萄糖苷酶的相對(duì)遷移率帶入方程，得出其分子質(zhì)量約為62 ku。

表1　異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶分離純化的結(jié)果

圖1異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

Fig.1Isoquercitrin-β-glycosidase in SDS-PAGE

2.2酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1溫度對(duì)相對(duì)酶活力的影響

將提純后的酶在20～70 ℃下進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)最適反應(yīng)溫度,將酶在各溫度條件下靜置1 h，在最適溫度下的進(jìn)行酶反應(yīng)檢測(cè)其溫度穩(wěn)定性。根據(jù)TLC結(jié)果得出該溫度下的相對(duì)酶活力，結(jié)果見圖2。

圖2　溫度對(duì)相對(duì)酶活力的影響

由圖2可知，最適酶反應(yīng)溫度為40 ℃。溫度在45 ℃以上時(shí)，隨著溫度的升高，相對(duì)酶活力呈下降趨勢(shì)，在50 ℃以下時(shí)，相對(duì)酶活力變化較為緩慢，都大于60%。而當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力急劇下降。

2.2.2pH對(duì)相對(duì)酶活力的影響

將提純后的酶在pH 2.0～10.0的緩沖體系內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，將酶在各緩沖體系中靜置1 h后，在最適pH條件下檢測(cè)其穩(wěn)定性。并計(jì)算不同pH條件下的相對(duì)酶活力，結(jié)果見圖3。

圖3　pH對(duì)相對(duì)酶活力的影響

由圖3可看出，該酶在pH 為5.0 時(shí)相對(duì)酶活力最大；pH在4.0～6.0，相對(duì)酶活力變化很小，其相對(duì)酶活力可以保持大于80%，超出該范圍酶活性急劇下降，因此確定該酶在pH 4.0～6.0 較穩(wěn)定。

2.2.3金屬離子對(duì)相對(duì)酶活力的影響

由表2可知，Na+、K+、Mg2+、Ca2+的存在不影響酶活力大小，反應(yīng)液中的Zn2+對(duì)異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活力的抑制作用隨著其濃度的增加而增大，而在Cu2+、Fe3+存在的情況下異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶沒有相對(duì)酶活力，因此Cu2+和 Fe3+可以完全抑制該酶的相對(duì)酶活力。

表2　金屬離子對(duì)相對(duì)酶活力的影響

2.2.4酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

配制底物質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的異槲皮苷溶液。在pH 5.0、40 ℃條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3 h，結(jié)果見表3。

采用Lineweaver-Burk作圖，由圖得到米氏方程為1/[V]=2.814/[S]+0.149，R2=0.998 9，從而計(jì)算得到最大反應(yīng)速度和米氏常數(shù)分別為6.711 mmol/(L·h) 及18.89 mmol/L。

表3底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響

Tab.3Theeffectsofsubstrateconcentrationonenzymereactionspeed

動(dòng)力學(xué)參數(shù)c/(mmol·L-1)2.1534.3076.4608.61410.767[S]-1/(L·mmol-1)0.4640.2320.1550.1160.093[V]-1/(L·h·mmol-1)1.4660.7730.5730.4840.429

3　結(jié)　論

從Absidiasp. R42g中提取的異槲皮苷葡萄糖苷酶，分子質(zhì)量大約為62 ku，最適反應(yīng)溫度為40 ℃，pH 5.0，具有較好的 pH耐受性和熱穩(wěn)定性，金屬離子 Na+、K+、Mg2+、Ca2+存在時(shí)對(duì)相對(duì)酶活力無影響，Zn2+對(duì)該酶的相對(duì)酶活力的抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)，Cu2+、Fe3+存在時(shí)可以完全抑制該酶的酶活力。由動(dòng)力學(xué)方程可得Vmax=6.711 mmol/(L·h)，Km=18.89 mmol/L。

[1] 周濃,楊勤,楊敏.HPLC法同時(shí)測(cè)定川楝子中蘆丁、異槲皮苷和槲皮素的含量[J].藥物分析雜志,2013,33(2):225-226.

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Purification and characterization of isoquercitrin-β-glucosidase

XUDan,JINFengxie,YUHongshan

(School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Isoquercitrin-β-glucosidasewaspurifiedfromAbsidiasp.R42gusingmolecularsieveandtheionexchangeseparationandpurification,anditsenzymaticpropertieswerestudied.Resultsshowedthatitsmolecularmasswasabout62ku,theoptimumtemperaturewas40 ℃,theoptimumpHwas5.0.Enzymewasstablebelow50 ℃atpH4.0-6.0.TheionsofNa+,K+,Ca2+showednoinfluenceonisoquercitrin-β-glucosidaseactivitybutionsFe3+andCu2+inhibitedisoquercitrin-β-glucosidase.Theenzymekineticsofisoquercitrin-β-glucosidasewereVmax=6.711mmol/(L·h)andKm=18.89mmol/L.

isoquercitrin-β-glucosidase; purification; enzymatic characterization

徐丹,金鳳燮,魚紅閃.異槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的分離純化及其酶性質(zhì)[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,35(4):243-245.

XU Dan, JIN Fengxie, YU Hongshan. Purification and characterization of isoquercitrin-β-glucosidase[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(4): 243-245.

2015-03-01.

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09503001-003).

徐 丹(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：魚紅閃(1968-)，男，教授.

TS201.3

A

1674-1404(2016)04-0243-03