蛋白質(zhì)糖基化改性方法和產(chǎn)物驗(yàn)證方法研究進(jìn)展

蘭秋雨 張 清 劉 琳 王宸之 李美麗 秦 文 楊文鈺

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

蛋白質(zhì)改性是通過一定的方法改變天然蛋白質(zhì)原有結(jié)構(gòu)或化學(xué)基團(tuán)的存在形式，以實(shí)現(xiàn)其功能特性的改變，從而滿足多種多樣的食品加工要求。蛋白質(zhì)的改性方法主要包括物理法、化學(xué)法、生物法和基因工程法[1]。糖基化改性以反應(yīng)過程溫和，無有毒有害試劑添加，改性后蛋白性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)成為一種理想的蛋白質(zhì)改性方法[2]。相對(duì)于單糖、二糖或寡糖糖基化所得軛合物而言，蛋白質(zhì)—多糖軛合物表現(xiàn)出了更加優(yōu)越的功能性質(zhì)[1]。本文中提到的蛋白質(zhì)糖基化，如無特別說明，均為蛋白質(zhì)與多糖的糖基化反應(yīng)。

蛋白質(zhì)糖基化改性主要基于美拉德反應(yīng)，利用蛋白質(zhì)與多糖進(jìn)行初級(jí)糖基化反應(yīng)，獲得的改性蛋白不僅集合了蛋白質(zhì)和多糖原有的功能特性，蛋白質(zhì)的乳化性、泡沫穩(wěn)定性、溶解性、致敏性、抗菌性、抗氧化性等功能特性也得到了改善[3]。蛋白質(zhì)糖基化改性研究自20世紀(jì)90年代初開始，經(jīng)過30年的發(fā)展，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)改性的重要方法。本文綜述了近年來不同蛋白質(zhì)糖基化改性方法的優(yōu)缺點(diǎn)，糖基化影響因素及如何選擇糖基化方法。并對(duì)蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物鑒定方法的檢驗(yàn)原理，優(yōu)缺點(diǎn)以及使用情況進(jìn)行介紹。

1 蛋白質(zhì)糖基化改性方法

目前蛋白質(zhì)糖基化方法主要包括干熱法、濕熱法和基于濕熱法衍生的一些輔助方法。干熱法糖基化具有操作簡單，反應(yīng)條件容易控制，無需加入其他試劑，反應(yīng)產(chǎn)物接枝度高等優(yōu)點(diǎn),但反應(yīng)時(shí)間較長。濕熱法糖基化具有反應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn),但反應(yīng)較為劇烈不易控制，反應(yīng)產(chǎn)物接枝度較低。不同的蛋白質(zhì)糖基化方法制備糖基化產(chǎn)物時(shí)在反應(yīng)速度、接枝度、可控性、產(chǎn)物空間結(jié)構(gòu)、功能特性上存在差異[4-5]。因此，在糖基化方法的選擇上需要對(duì)蛋白質(zhì)和糖發(fā)生糖基化的難易程度、糖基化效果、糖基化所需時(shí)間和溫度等因素進(jìn)行綜合考慮。

1.1 干熱法糖基化

干熱法糖基化是最先使用的蛋白質(zhì)糖基化方法，也是蛋白質(zhì)糖基化處理的最主要方法。通常，先將蛋白質(zhì)和多糖按一定比例在水溶液中進(jìn)行混合，經(jīng)干燥得到兩者的混合粉末，然后在一定的溫度、濕度和時(shí)間條件下誘導(dǎo)糖基化反應(yīng)，反應(yīng)完畢后迅速冷卻以終止糖基化反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間通常為幾天到幾周。

干熱法糖基化過程中的主要影響因素包括反應(yīng)溫度、濕度、時(shí)間、底物的結(jié)構(gòu)和比例等[6]。其中反應(yīng)溫度對(duì)糖基化效果有很大影響，溫度過低，反應(yīng)時(shí)間較長，反應(yīng)過程難以控制，溫度過高，容易導(dǎo)致過度糖基化，使美拉德反應(yīng)進(jìn)入中后期，產(chǎn)物組成復(fù)雜，甚至產(chǎn)生有致癌作用的AGEs(晚期糖基化終末產(chǎn)物)。因此，干熱法糖基化的反應(yīng)溫度一般控制在40～60 ℃，以60 ℃最為常見。反應(yīng)濕度是指蛋白質(zhì)糖基化過程中的環(huán)境相對(duì)濕度。反應(yīng)濕度的高低會(huì)影響反應(yīng)過程中的水分活度進(jìn)而影響反應(yīng)速率。目前，對(duì)于反應(yīng)濕度的控制一般通過在干燥器中放置飽和的鹽溶液來實(shí)現(xiàn)。反應(yīng)濕度的選擇要根據(jù)蛋白質(zhì)和多糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的難易程度來確定。

反應(yīng)時(shí)間直接影響蛋白質(zhì)糖基化的效果。由于干法糖基化只是將蛋白質(zhì)與多糖的混合粉末在一定溫度和濕度下進(jìn)行處理，蛋白質(zhì)與糖接觸不充分，一般反應(yīng)時(shí)間較長。反應(yīng)時(shí)間和溫度是美拉德反應(yīng)的重要影響因素，兩者相互影響。隨著溫度的升高，反應(yīng)時(shí)間相應(yīng)縮短，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)糖基化效率。Zhang等[7]將對(duì)比分析了大豆分離蛋白(Soy protein isolate，SPI)與麥芽糖糊精在不同溫度條件下干法反應(yīng)2 h產(chǎn)生軛合物的糖基化程度和理化性質(zhì)，結(jié)果顯示140 ℃ 下生成的軛合物糖基化程度最高(26%)，環(huán)境穩(wěn)定性更好。Liu等[8]將麥芽糖糊精和乳清分離蛋白在80 ℃下進(jìn)行了干法糖基化處理2 h，發(fā)現(xiàn)改性后的乳清分離蛋白在pH值3～7、0.00～0.15 mol/L的氯化鈉或氯化鈣溶液等條件下表現(xiàn)良好的透明分散狀態(tài)；并且熱變性溫度也得到提高。之后，Liu等[9]在對(duì)麥芽糖糊精改性乳清分離蛋白時(shí)的糖基化時(shí)，溫度提高到130 ℃，時(shí)間縮短至30 min以下，結(jié)果顯示乳清分離蛋白—麥芽糖糊精軛合物具有較高的熱穩(wěn)定性、溶解性和鹽離子耐受性；并且軛合物的顏色或5-羥甲基-2-糠醛含量均比在80 ℃和2 h條件下所得軛合物的淺或低。高溫干熱法蛋白質(zhì)糖基化方法有效縮短了蛋白質(zhì)糖基化改性所需時(shí)間，甚至還獲得了更好的品質(zhì)特性。然而，目前此法僅應(yīng)用于SPI和乳清分離蛋白的糖基化中，該方法是否具有廣普性還需要進(jìn)一步研究。

糖基化反應(yīng)底物的比例也是影響蛋白質(zhì)糖基化效果的重要因素。一般情況下蛋白質(zhì)和糖的比例是指蛋白質(zhì)和糖的質(zhì)量比。也有學(xué)者[10]根據(jù)蛋白質(zhì)和多糖的結(jié)合位點(diǎn)將蛋白質(zhì)糖基化底物質(zhì)量比細(xì)化為氨基和羰基的摩爾比例。此外，糖的分子量大小和糖鏈的長度會(huì)影響蛋白質(zhì)糖基化效果[11]。因此在反應(yīng)時(shí)間的控制上還需要考慮蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。

干熱法糖基化所需反應(yīng)時(shí)間較長，耗能高，產(chǎn)出效率低，是干法糖基化工業(yè)化的難點(diǎn)。使用干熱法進(jìn)行蛋白質(zhì)糖基化時(shí)，為了使兩者能夠充分接觸，通常要將其溶解后進(jìn)行干燥，然后進(jìn)行糖基化反應(yīng)。目前常用冷凍干燥，能夠避免干燥過程中糖和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生具有致癌性的晚期糖基化終末產(chǎn)物。而冷凍干燥的成本較高，增加了蛋白的干法糖基化處理的工業(yè)化應(yīng)用成本。

1.2 濕熱法糖基化

1.2.1 傳統(tǒng)濕熱法 蛋白質(zhì)濕熱法糖基化是基于液相對(duì)蛋白和糖進(jìn)行熱處理從而使蛋白質(zhì)糖基化改性的一種方法，多用于蛋白質(zhì)與小分子糖之間的接枝反應(yīng)[3]。由于蛋白質(zhì)和多糖基于液相反應(yīng)，兩者充分接觸，反應(yīng)迅速，能夠大大縮短糖基化反應(yīng)時(shí)間。但是由于美拉德反應(yīng)的初級(jí)反應(yīng)為可逆反應(yīng)，水作為初級(jí)反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物在體系中大量存在，抑制了糖基化反應(yīng)的進(jìn)行。另一方面，蛋白質(zhì)在水中進(jìn)行高溫處理容易發(fā)生變性聚集，加速反應(yīng)向高級(jí)階段進(jìn)行，甚至生成有毒有害物質(zhì)，如丙烯酰胺和4-甲基咪唑等[1]。因此濕熱法糖基化存在反應(yīng)不完全，接枝度低，產(chǎn)物復(fù)雜，反應(yīng)難控制的問題。目前已有研究通過添加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)[12]、超聲波技術(shù)[13]、脈沖電場技術(shù)[14]和高壓處理技術(shù)[15]等輔助措施來提高蛋白質(zhì)糖基化效果控制反應(yīng)程度。

1.2.2 酶法糖基化 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)能夠催化蛋白質(zhì)分子中谷氨酰胺殘基(γ-甲酰胺基)與賴氨酸殘基(ε-氨基)生成共價(jià)鍵，形成交聯(lián)蛋白，發(fā)生交聯(lián)后的蛋白質(zhì)分子中的賴氨酸殘基又易被伯胺類物質(zhì)所取代。濕熱法糖基化利用TGase該特性催化具有伯氨基團(tuán)的多糖與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，制備糖基化交聯(lián)蛋白。TGase催化糖基化反應(yīng)所得的糖基化產(chǎn)物具有更好的溶解性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性和凝膠特性[16]。全越等[12]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了轉(zhuǎn)谷酰胺酶催化燕麥麥麩球蛋白糖基化接枝條件，得到當(dāng)氨基糖與蛋白濃度比為0.94∶1.00、TG酶添加量為57.59 U/g、pH值為7.65、時(shí)間為4 h、溫度為45 ℃時(shí)糖基化接枝度最高(45.677 4%)。TGase能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行酶法改性，同時(shí)也是催化蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，是一種綠色健康的蛋白質(zhì)改性方式。

1.2.3 旋轉(zhuǎn)圓盤反應(yīng)器 旋轉(zhuǎn)圓盤反應(yīng)器是一種多級(jí)串聯(lián)混合反應(yīng)器，主要用于聚酯終縮聚反應(yīng)。目前有學(xué)者[17]提出將其用于蛋白質(zhì)糖基化處理中的可能性。蛋白質(zhì)—多糖混合液進(jìn)入旋轉(zhuǎn)圓盤中，在加熱和離心力的作用下形成微米級(jí)的薄膜，提高圓盤和混合液之間的傳熱系數(shù)?；旌弦涸诜磻?yīng)器中循環(huán)直至得到目標(biāo)糖基化產(chǎn)物。旋轉(zhuǎn)圓盤反應(yīng)器能夠明顯縮短反應(yīng)時(shí)間，降低能耗[18]。目前，尚未有關(guān)于旋轉(zhuǎn)圓盤反應(yīng)器應(yīng)用于蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)處理的報(bào)道。

1.2.4 超聲波輔助法 超聲波是一種常見的物理方法，因其機(jī)械作用和空化作用被廣泛應(yīng)用于食品加工和品質(zhì)改良方面[19]。與傳統(tǒng)的濕式加熱相比，超聲輔助法可以提高接枝反應(yīng)的效率，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高蛋白質(zhì)—多糖軛合物的溶解度、乳化性質(zhì)、表面疏水性和凝膠特性[19]。Zhang等[20]對(duì)比傳統(tǒng)濕熱法和超聲輔助濕熱法制備β-大豆球蛋白—麥芽糊精軛合物，結(jié)果表明超聲處理能夠加速接枝過程并且獲得功能特性更加優(yōu)異的蛋白質(zhì)—多糖軛合物。Li等[21]將超聲波技術(shù)應(yīng)用于花生分離蛋白分別與葡聚糖和阿拉伯膠之間的濕法糖基化處理，同時(shí)與傳統(tǒng)的濕熱法處理對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲處理后，花生分離蛋白與2種多糖的接枝度顯著增加，且所得糖基化產(chǎn)物的L值變大而b值變小。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來看，超聲處理后的糖基化產(chǎn)物具有更少的α-螺旋和較為松散的三級(jí)結(jié)構(gòu)，以及更多的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和更高的表面疏水結(jié)構(gòu)；從功能特性來看，超聲處理所得的2種花生分離蛋白糖基化產(chǎn)物的溶解性和乳化性都得到了提高。所以，在相同糖基化處理?xiàng)l件下，超聲波有助于蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，從而制備出顏色較淺和功能特性更優(yōu)的改性蛋白質(zhì)[22]。超聲輔助處理不僅能夠縮短接枝反應(yīng)時(shí)間，還能改善接枝產(chǎn)物功能特性，是一種快速有效的蛋白質(zhì)濕熱糖基化的輔助方法。

1.2.5 脈沖電場輔助法 高壓脈沖電場(pulsed electric fields，PEF)是一種液態(tài)食品非熱處理加工技術(shù)，主要用于食品殺菌、提高酶活、物質(zhì)提取，改善食品品質(zhì)和食品保鮮等方面[23-25]。Guan等[14]將400 mg BSA與400 mg葡聚糖混合，然后溶于190 mL去離子水。將溶液的初始pH調(diào)節(jié)至10.0后定容到200 mL。使用脈沖持續(xù)時(shí)間為25 μs，脈沖頻率為1.04 kHz的脈沖電場處理牛血清蛋白和葡聚糖混合溶液，結(jié)果表明脈沖電場能夠促進(jìn)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。涂宗財(cái)?shù)萚26]研究了高壓脈沖電場對(duì)β-乳球蛋白(β-Lg)糖基化的抗原性和結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示PEF處理能夠明顯降低β-Lg糖基化產(chǎn)物的抗原性。但是未對(duì)高壓脈沖電場處理前后的糖基化產(chǎn)物的抗原性進(jìn)行比較。脈沖電場能夠促進(jìn)糖基化進(jìn)行，改善蛋白功能特性，提高產(chǎn)物接枝度，抑制美拉德反應(yīng)高階產(chǎn)物的生成。

1.2.6 其他輔助方法 一些非熱加工技術(shù)也被用于蛋白質(zhì)的濕熱法糖基化改性過程，如高壓處理，微波處理，動(dòng)態(tài)高壓微射流等。有學(xué)者[15]在10 MPa的條件下對(duì)葡聚糖和β-大豆球蛋白進(jìn)行濕熱法糖基化處理，發(fā)現(xiàn)高壓情況下接枝反應(yīng)加速并且降低了褐變速率。與常壓下所獲得的軛合物相比，高壓處理所得的軛合物具有更高的接枝度和更好的乳化性。孟祥勇等[27]對(duì)米渣蛋白和海藻酸鈉進(jìn)行了相同的處理，發(fā)現(xiàn)微波處理能夠提高接枝速度，操作簡單，方便控制，是一種高效、安全的蛋白質(zhì)改性方法。鐘俊楨等[28]對(duì)β-Lg進(jìn)行動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)協(xié)同葡聚糖糖基化處理后，結(jié)果表明動(dòng)態(tài)高壓微射流處理會(huì)使β-Lg的表面疏水性明顯升高，內(nèi)源熒光光強(qiáng)降低，并且改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)蛋白質(zhì)糖基化的進(jìn)行。此外，一些非熱處理如高靜壓、高密度二氧化碳等也具備用于蛋白質(zhì)糖基化改性的可能。

2 蛋白質(zhì)糖基化的鑒定方法

蛋白質(zhì)糖基化改性主要是利用美拉德反應(yīng)的初期反應(yīng)，使蛋白質(zhì)和多糖生成美拉德初級(jí)產(chǎn)物即蛋白質(zhì)—多糖軛合物。但是由于美拉德反應(yīng)較為復(fù)雜，如果控制不當(dāng)，反應(yīng)很容易進(jìn)入中期甚至末期，產(chǎn)生黑色素和有毒有害物質(zhì)。因此需要采取適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)糖基化產(chǎn)物或糖基化反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行檢測分析。目前常用的方法有分光光度法、凝膠電泳、色譜法、光譜法、顯微分析法和質(zhì)譜法等。在鑒定蛋白質(zhì)糖基化過程時(shí)，往往需要選擇幾種方法來綜合評(píng)價(jià)。

2.1 分光光度法

分光光度法可以通過測定軛合物中蛋白質(zhì)的自由氨基含量來表示軛合物的接枝程度，即接枝度，也可以通過測定美拉德反應(yīng)中呈色物質(zhì)的含量表示美拉德反應(yīng)進(jìn)程，即褐變程度。常用的接枝度測定方法有鄰苯二甲醛(OPA)法和2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)法。其中OPA法快速，顯色劑穩(wěn)定性好，安全性較好，是目前最常用的測定自由氨基含量的方法。褐變程度測試只需要將糖基化產(chǎn)物加入SDS使其充分溶解后在420 nm下測定吸光度。在以往的研究中使用較少。另外，褐變程度還可以利用色差儀進(jìn)行測定。分光光度法具有檢測快速、操作簡單、對(duì)設(shè)備要求低、樣品前處理方便等優(yōu)點(diǎn)，但也存在精確度不高的缺點(diǎn)，通常要結(jié)合其他檢測方法使用。

2.2 凝膠電泳分析

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是常見的判斷糖基化反應(yīng)程度的鑒定方法，通常參考Laemmli[29]的方法。其中染色方法包括考馬斯亮藍(lán)染色和PAS (Periodic Acid-Schiff stain)染色2種?？捡R斯亮藍(lán)染色法得到的凝膠可以通過對(duì)比原蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)—多糖軛合物的蛋白質(zhì)條帶判斷糖基化反應(yīng)是否進(jìn)行，是最常用的染色方法。PAS染色是通過過碘酸的氧化作用，使多糖暴露出醛基，醛基與無色堿性品紅結(jié)合反應(yīng)，與多糖存在的部位形成新的紫紅色復(fù)合物，使糖蛋白條帶呈紅色。PAS染色通常結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色使用，能夠更加準(zhǔn)確地表現(xiàn)出糖鏈的結(jié)合情況[30]。SDS-PAGE能夠直觀地顯示出蛋白質(zhì)與多糖的結(jié)合情況，能夠有效鑒定蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)是否發(fā)生，但是不能進(jìn)行定量。

2.3 高效排阻色譜法

由于蛋白質(zhì)和多糖都是大分子物質(zhì)，很多蛋白質(zhì)和多糖的軛合物分子量較大。針對(duì)性分析大分子物質(zhì)的特點(diǎn)，排阻色譜法通過將溶質(zhì)分子尺寸進(jìn)行分離，分子量級(jí)范圍為10～2 000 kDa，很好地解決了經(jīng)典高效液相色譜難以檢測大分子物質(zhì)的難題[31]。高效排阻色譜法(HPSEC)利用孔徑不同的填料，溶劑中的大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)直接流出，小分子后流出，將溶質(zhì)分子按照體積大小分離，是蛋白質(zhì)糖基化改性后的產(chǎn)物分子量分布分析的常用手段之一。HPSEC可以提供較為清晰的表征糖基化產(chǎn)物的分子量分布色譜圖，相對(duì)于原蛋白或原蛋白和多糖混合物的色譜圖而言，軛合物的HPSEC圖譜在更少的保留體積范圍內(nèi)有出峰，表明有分子量更大的軛合物產(chǎn)生[32]。然而，HPSEC只能顯示是否有分子量更大的物質(zhì)產(chǎn)生、生成物分子量分布情況和相對(duì)定量，而并不能準(zhǔn)確對(duì)糖基化反應(yīng)的程度進(jìn)行定量分析。

2.4 拉曼光譜法

拉曼光譜是一種研究分子結(jié)構(gòu)的分析方法，憑借其樣品前處理簡單、樣品無損、操作簡單、檢出快速等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[33]。基于對(duì)拉曼光譜吸收峰變化的對(duì)比分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)—多糖軛合物的鑒別。Wang等[34]利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對(duì)乳清分離蛋白和葡聚糖的糖基化產(chǎn)物進(jìn)行了鑒別研究，結(jié)果顯示在乳清分離蛋白—葡聚糖軛合物在983 cm-1處出現(xiàn)了特征峰，該特征峰主要與羰基和氨基發(fā)生美拉德反應(yīng)生成的C—N鍵相對(duì)應(yīng)，反映了蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)處的蛋白骨架的構(gòu)型變化。此外，有學(xué)者[35]利用臨界干燥態(tài)拉曼光譜技術(shù)對(duì)乳清分離蛋白—葡聚糖軛合物進(jìn)行了鑒別。拉曼光譜測定時(shí)所需樣品量少，操作簡單，檢出迅速。拉曼光譜技術(shù)是糖基化蛋白鑒別的又一快速有效的方法。

2.5 傅立葉紅外光譜法

傅立葉紅外光譜(Fourier Transform Infrared，F(xiàn)TIR)可以對(duì)蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行表征，是一種常用的分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的方法。蛋白質(zhì)與多糖分子發(fā)生接枝反應(yīng)后，蛋白質(zhì)分子的羥基含量增加，在紅外光譜中表現(xiàn)為羥基的吸收峰峰面積增大。另一方面，蛋白質(zhì)與多糖分子糖基化后蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶的吸收峰變化。其中酰胺Ⅰ帶1 600～1 700 cm-1能夠反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。宋永令等[36]通過FTIR證實(shí)葡聚糖與谷朊粉發(fā)生糖基化反應(yīng)。Oliver等[37]借助多元統(tǒng)計(jì)分析、主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)糖基化酪蛋白和酪蛋白之間的分子結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析判定。傅立葉紅外光譜通常采用透射法對(duì)樣品進(jìn)行檢測，對(duì)一些難溶、難粉碎的樣品的測試存在困難。衰減全反射(ATR)方法基于光內(nèi)反射原理進(jìn)行檢測，能夠很好地解決上述問題。并且簡化了樣品的制作過程。

2.6 圓二色譜法

圓二色譜法(circular dichroism，CD)是測定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最有效的方法之一，通過分析接入糖鏈后蛋白質(zhì)部分α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況，對(duì)蛋白質(zhì)的糖基化改性產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。也有研究[38]采用CD對(duì)乳清分離蛋白用葡聚糖糖基化前后的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)糖基化處理對(duì)其4種二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成并沒有顯著性影響，這可能與糖基化的蛋白種類、多糖種類和糖基化程度有關(guān)。然而，多糖鏈接入蛋白質(zhì)分子中后，會(huì)引起各種二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化，所以圓二色譜法在對(duì)蛋白質(zhì)糖基化進(jìn)行表征時(shí)具有針對(duì)性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。

2.7 熒光光譜法和紫外光譜法

熒光光譜利用美拉德反應(yīng)有呈色物質(zhì)生成，熒光物質(zhì)是美拉德反應(yīng)的高階產(chǎn)物的前體物，通過對(duì)比熒光強(qiáng)度，反映糖基化反應(yīng)的程度。張曦[39]利用大豆7S蛋白的內(nèi)熒光基團(tuán)在270～500 nm有吸收峰的特性，通過對(duì)吸收峰的對(duì)比判斷糖基化產(chǎn)物偶聯(lián)程度。紫外光譜是一種常見的蛋白質(zhì)構(gòu)象研究方法。其中遠(yuǎn)紫外區(qū)吸收光信號(hào)來源于肽鏈，能夠反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，近紫外區(qū)吸收的則來源于芳香族化合物，能夠反應(yīng)蛋白質(zhì)側(cè)鏈和二硫鍵變化。李曉明等[40]采用紫外分光光度法對(duì)不同活性羰基與β-Lg糖基化產(chǎn)物進(jìn)行全波長掃描，通過對(duì)比原蛋白與糖基化蛋白的近紫外分光光譜發(fā)現(xiàn)在280 nm波長處存在酪氨酸和色氨酸的特征峰，糖基化產(chǎn)物在此處的吸光度增強(qiáng)，進(jìn)而判斷糖基化蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

2.8 差示掃描量熱法

差示掃描量熱法(Differential Scanning Calorimeter，DSC)可以對(duì)蛋白質(zhì)的變性溫度和熱焓進(jìn)行測定，被用于表征蛋白質(zhì)糖基化的結(jié)構(gòu)變化。一般情況下，糖鏈的接入能夠增加蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，表現(xiàn)為熱變性溫度升高。Boostani等[41]利用DSC對(duì)大豆分離蛋白—右旋糖酐軛合物的變性溫度進(jìn)行測定，結(jié)果表明糖基化后的蛋白質(zhì)熱變性溫度明顯增加。對(duì)于大部分蛋白質(zhì)來講，糖基化改性后其熱變形溫度都有所升高，但是當(dāng)糖鏈較短時(shí)，糖鏈的接入不能充分發(fā)揮其空間位阻效應(yīng)會(huì)抑制展開的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，從而對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性影響較小[42]。故DSC不適合對(duì)短鏈糖基化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。作為一種基于熱力學(xué)性質(zhì)探究的方法，蛋白質(zhì)的熱分析可以有效從分子結(jié)構(gòu)層面探討蛋白質(zhì)糖基化改性進(jìn)程。

2.9 電子顯微分析法

電子顯微分析方法是一種分析物體形態(tài)微觀形貌、結(jié)構(gòu)特征觀察手段，能夠直觀地表現(xiàn)原子或分子水平的大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、形態(tài)。其中掃描電鏡主要是通過對(duì)比原蛋白與糖基化蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)，分析蛋白質(zhì)與糖是否發(fā)生接枝反應(yīng)。由于單糖和部分低聚糖分子量小，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變較小，電子顯微分析方法不能直接觀察到其結(jié)構(gòu)變化。Yadav等[43]對(duì)乳清蛋白與玉米纖維膠糖基化反應(yīng)前后的掃描電鏡圖進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明糖基化產(chǎn)物的微觀結(jié)構(gòu)與原蛋白或者兩者混合物的微觀結(jié)構(gòu)相比，表面粗糙、形態(tài)不規(guī)則和更加緊湊，說明發(fā)生了接枝反應(yīng)，從而與SDS-PAGE和FTIR的鑒定結(jié)果相呼應(yīng)。其他蛋白質(zhì)糖基化改性后，也表現(xiàn)出更緊湊和非均一的微觀結(jié)構(gòu)，如大豆蛋白與梧桐膠綴合物[44]、豌豆蛋白與果膠綴合物[45]、大豆蛋白與葡聚糖綴合物[46]。

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)糖基化方法多種多樣，在方法選擇時(shí)需要根據(jù)底物種類結(jié)合的難易程度、目標(biāo)改性效果、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度等方面進(jìn)行綜合考慮。目前，對(duì)于不常見多糖對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改性時(shí)一般采用干熱法。而對(duì)濕熱法的研究主要集中在對(duì)濕熱法糖基化反應(yīng)條件的優(yōu)化，濕熱法糖基化的機(jī)理，輔助處理對(duì)濕熱法糖基化產(chǎn)物的影響等方面。隨著蛋白質(zhì)糖基化改性的廣泛應(yīng)用，對(duì)糖基化改性方法也有了更高的要求。如何根據(jù)生產(chǎn)要求選擇蛋白質(zhì)種類，如何對(duì)糖基化方法進(jìn)行合理設(shè)置，如何對(duì)蛋白質(zhì)糖基化程度進(jìn)行精準(zhǔn)控制，如何在保證糖基化蛋白的安全性與營養(yǎng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)其更好的利用都是現(xiàn)代食品工業(yè)生產(chǎn)面臨的問題。所以，需要對(duì)蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物有更精準(zhǔn)的鑒別。蛋白質(zhì)—多糖軛合物與原蛋白質(zhì)相比，在分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等方面表現(xiàn)了截然不同的特點(diǎn)，如氨基酸組成變化、分子量增大、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成變化、增加多糖—蛋白質(zhì)共價(jià)鍵(如C—N)、光譜吸收變化、微觀形態(tài)變化和熱變性溫度變化等。所以基于這些特點(diǎn)，可以選擇適當(dāng)?shù)臋z測方法對(duì)蛋白質(zhì)的糖基化過程進(jìn)行鑒定。在現(xiàn)有報(bào)道的各種檢測方法中，每種方法都有其側(cè)重點(diǎn)，使得在實(shí)際鑒定蛋白質(zhì)糖基化過程時(shí)，往往都需要選擇幾種方法來綜合評(píng)價(jià)。