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    蛋雞群沙門氏菌的監(jiān)測

    2016-08-29 09:08:33呂殿紅溫肖會翟少倫楊燕秋周秀蓉魏文康
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年19期
    關(guān)鍵詞:白痢雞場沙門氏菌

    呂殿紅,溫肖會,翟少倫,黃 忠,楊燕秋,周秀蓉,魏文康

    (廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室,廣東廣州 510640)

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    蛋雞群沙門氏菌的監(jiān)測

    呂殿紅,溫肖會,翟少倫,黃 忠,楊燕秋,周秀蓉,魏文康*

    (廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室,廣東廣州 510640)

    [目的]了解蛋雞場沙門氏菌的感染情況。[方法]采用沙門氏菌抗原和抗體檢測方法對2012~2015年采集的廣東省蛋雞場樣品進行檢測。采用ELISA方法對1784血清樣品進行了腸炎沙門氏菌和1 387份血清樣品進行了鼠傷寒沙門氏菌抗體檢測;采用凝集試驗方法對1 391份血清樣品進行了雞白痢沙門氏菌抗體檢測;采用細菌培養(yǎng)、PCR方法對采自廣東省的活雞/死雞、環(huán)境拭子等1 458份樣品進行了沙門氏菌檢測。[結(jié)果]腸炎、鼠傷寒、雞白痢3種血清型沙門氏菌抗體的陽性率分別為16.70%、10.09%和1.01%;沙門氏菌抗原檢測的陽性率為1.65%。[結(jié)論]蛋雞群中存在腸炎、鼠傷寒、雞白痢等3種沙門氏菌不同程度的感染,但是蛋雞群的總體感染率不高。

    沙門氏菌;感染;抗體;陽性率

    沙門氏菌是常見的腸道病原菌之一,在自然界分布廣泛、種類繁多,目前已檢測出沙門氏菌血清型2 500余種,據(jù)報道在我國存在的血清型有292種[1]。沙門氏菌所導(dǎo)致的疾病統(tǒng)稱沙門氏菌感染。沙門氏菌不僅能引起動物發(fā)生急性、慢性或隱性感染,而且還能通過污染食物導(dǎo)致人的食物中毒,引發(fā)敗血癥等,對人類健康造成很大的威脅。在世界各國的各類細菌性食物中毒事件中,沙門氏菌引起的食物中毒常居榜首。2000年,在科技部和衛(wèi)生部的支持下,中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所建立的全國食品污染物監(jiān)測體系對食品中的污染物進行了連續(xù)主動監(jiān)測,食源性致病菌的監(jiān)測指標選取沙門氏菌,這是因為在我國內(nèi)陸地區(qū)細菌性食物中毒的暴發(fā)例數(shù)和發(fā)病人數(shù)多年來排第1位就是沙門氏菌感染。沙門氏菌是公共衛(wèi)生意義上具有重要意義的人獸共患病原菌之一,最為常見的人獸共患的沙門氏菌有鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等。我國城鄉(xiāng)居民對雞蛋的消耗量占禽蛋消費量的85%以上,近十多年來年消耗量都超過2 000萬t[2],如果蛋雞場存在沙門氏菌的污染,將直接影響到雞蛋的質(zhì)量,對人民健康存在巨大的威脅,因此加強蛋雞場的沙門氏菌監(jiān)測十分重要。筆者于2012年7月至2015年12月對廣東省部分地區(qū)蛋雞群進行沙門氏菌監(jiān)測,以期為沙門氏菌的凈化和預(yù)防提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1樣品采集 來自廣東省的不同雞場115批次樣品,采集時間為2012年7月至2015年12月底。用于檢測腸炎沙門氏菌抗體的雞血清樣品1 784個,用于檢測鼠傷寒沙門氏菌抗體的樣品1 387份,用于檢測雞白痢沙門氏菌抗體1 391份;供檢測沙門氏菌的樣品1 458份,包括1日齡~56周齡的活雞1 222只、死亡雞48只、雞場環(huán)境拭子16份、環(huán)境和雞糞混合樣品128份、墊紙44份。以上商品代雞場均為存欄量超過10萬只以上的雞場。樣品來源和數(shù)量等具體見表1。

    1.2樣品處理對用于抗原檢測的活雞、死亡雞樣品無菌取內(nèi)臟及腸內(nèi)容物剪碎,加入滅菌的PBS充分研磨;將環(huán)境拭子直接置于滅菌的PBS中混勻;環(huán)境和雞糞混合樣品以及墊紙搗碎后與無菌PBS充分混合,過濾后取上清待用。

    對上述PBS混合液進行增菌處理:取1 mL接種于10 mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)內(nèi),于(42±1)℃培養(yǎng)18~24 h。同時,另取1 mL接種于10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)內(nèi),于(36±1)℃培養(yǎng)18~24 h。

    1.3試劑/試劑盒、引物和沙門氏菌陽性菌 腸炎沙門氏菌抗體(SE-Ab)和鼠傷寒沙門氏菌抗體(ST-Ab)試劑盒均為荷蘭Biochek公司產(chǎn)品(由北京天之泰生物科技有限公司提供);雞白痢凝集抗原、陽性血清、陰性血清,均購自北京中海科技有限公司;沙門氏菌培養(yǎng)基TTB和SC、顯色培養(yǎng)基均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。針對沙門氏菌侵襲蛋白 A(invasionprotein A,invA)基因,參考文獻[3]方法設(shè)計PCR引物,由上海英濰捷基生物有限公司合成。沙門氏菌陽性菌株,購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

    1.4抗體水平檢測

    1.4.1腸炎沙門氏菌抗體和鼠傷寒沙門氏菌抗體的ELISA檢測。 血清樣品按1∶100的比例進行稀釋,將100 μL稀釋后的樣品添加到相應(yīng)的酶標板孔內(nèi),室溫孵育30 min,倒出孔內(nèi)容物,洗滌4次,最后1次倒轉(zhuǎn)反應(yīng)板,在吸水紙上輕輕拍打。然后,每孔添加100 μL酶標二抗,室溫孵育30 min,洗滌4次;每孔加入100 μL底物,室溫下孵育15 min;加入100 μL終止液,終止反應(yīng),調(diào)零,使用酶標儀于405 nm波長處測定各孔吸光值。檢測時設(shè)置陽性和陰性對照,當陰性對照的平均吸光度小于0.3,陽性對照的平均吸光度大于等于0.3,二者之間的差值大于0.15,說明檢測結(jié)果可靠。S/P值=(待檢樣品的平均吸光度-陰性樣品的平均吸光度)/(陽性樣品的平均吸光度-陰性樣品的平均吸光度)。若S/P值≤0.499,說明樣品抗體為陰性;若S/P值≥0.500,說明樣品抗體值為陽性。

    1.4.2雞白痢抗體檢測。采用平板凝集方法,用吸管吸取抗原50 μL,垂直滴加在潔凈玻璃板上,然后吸取50 μL雞血清,與抗原充分混合均勻,并使其散開至直徑為2 cm。不斷搖動玻璃板,計時判定結(jié)果,同時設(shè)置強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清對照。

    1.5抗原檢測取增菌液在沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基上劃線,結(jié)合培養(yǎng)特性,取可疑菌落接種至LB液體培養(yǎng)基內(nèi),提取DNA。以提取的DNA為模板,采用PCR方法[3]進行驗證試驗,擴增的目的片段為403 bp。

    2 結(jié)果與分析

    對采集的血清樣品進行腸炎沙門氏菌抗體、鼠傷寒沙門氏菌抗體、雞白痢抗體檢測,不同時期幾種抗體的陽性率不同(表1)。沙門氏菌在沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基上呈現(xiàn)特征的紫紅色圓形菌落(圖1),挑取疑似菌落進行PCR驗證,均出現(xiàn)目的條帶。沙門氏菌PCR鑒定的結(jié)果見圖2,沙門氏菌的分離情況及分離率見表1。

    表1 不同來源樣品幾種沙門氏菌抗體和沙門氏菌的檢測結(jié)果

    圖1 沙門氏菌在沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基上的觀察結(jié)果Fig.1 Observation results of salmonella in differential mediums

    注:M.DNA 標準DL2000;1~8.沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基上疑似陽性樣品;9.陽性對照;10.陰性對照。Note:M.DNA marker DL2000; 1-8.Suspected samples in differential mediums; 9.Positive control; 10.Negative control.圖2 部分沙門氏菌陽性樣品的PCR驗證結(jié)果Fig.2 Results of PCR verification of salmonella positive samples

    3 討論與結(jié)論

    沙門氏菌是1885年由沙門氏等在霍亂流行時分離到豬霍亂沙門氏菌,因此定名為沙門氏菌屬。沙門氏菌的存在嚴重威脅著人民的身體健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展其在養(yǎng)殖場的存在也時有報道[4-9],對養(yǎng)殖業(yè)的危害很大,另外由于獸藥的濫用,導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性的增強[10-11],給該病的防治帶來很大困難。實時跟蹤監(jiān)測對于有效防止沙門氏菌感染的擴散、為畜禽產(chǎn)品的安全提供有效保障。

    該研究結(jié)果表明,廣東省部分地區(qū)蛋雞群中存在腸炎、鼠傷寒、雞白痢等幾種沙門氏菌的感染,但是雞群總體感染率不高。這可能與監(jiān)測樣品多數(shù)來自大型雞場有關(guān),大型雞場管理相對完善、飼養(yǎng)條件相對較好使沙門氏菌的流行傳播受阻。相對而言,小型雞場及散養(yǎng)雞環(huán)境較差條件較簡陋,容易流行和爆發(fā)沙門氏菌[12],因此對小型雞場沙門氏菌的監(jiān)測和防控將是今后工作的重點,建議相關(guān)部門和機構(gòu)加以重視。

    2012年監(jiān)測結(jié)果表明,父母代的雞場環(huán)境中檢測到沙門氏菌,因此在2013年加大對雞場血清中3種沙門氏菌抗體的監(jiān)測力度,并且對雞群加強飼養(yǎng)管理、對雞場生物安全等方面加大防控力度,2015年已經(jīng)獲得改善。這充分說明了加強飼養(yǎng)管理和防控措施等對控制動物疫病的重要性。

    該研究中檢出的沙門氏菌的24個陽性樣品,包括18個環(huán)境拭子和6個來自雛雞的肝臟和卵黃中的樣品。這與文獻[13-14]的報道相一致。筆者未對雞二蛋和蛋殼上的沙門氏菌進行監(jiān)測,但是蛋雞場沙門氏菌的存在必然導(dǎo)致雞蛋的污染機會增多,據(jù)報道雞蛋和雞蛋殼沙門氏菌的污染率不低[15],人們在食用雞蛋時接觸蛋殼,很容易造成間接感染,因此建議雞蛋食用前進行清潔處理。雖然我國人民習(xí)慣吃熟食,但是隨著中西文化的交流,一些外來飲食習(xí)慣(如生食等)逐漸被國人接受,因此加強沙門氏菌的控制十分重要,應(yīng)切斷其傳播途徑,保障人類和動物健康。

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    Monitoring of Salmonella in Laying Hens

    LU Dian-hong, WEN Xiao-hui, ZHAI Shao-lun, WEI Wen-kang*et al

    (Institute of Veterinary Medicine, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention, Guangzhou, Guangdong 510640)

    [Objective] To study infection of laying hens with salmonella. [Method] The antigen and antibody of salmonella in laying hens collected from Guangdong Province during 2012-2015 were detected. ELISA method and aggregation test were used to detect the antibody titer of serum samples aboutSalmonellaenteritidis,SalmonellatyphimuriumandSalmonellapullorum, and then germiculture and PCR were used to check out salmonella from chickens and environment swabs. [Result] Positive rates of three kinds of antibody were 16.70%, 10.09% and 1.01% respectively, while the positive rate of salmonella antigen was 1.65%. [Conclusion] The laying hens are infected with the three kinds of salmonella, but their infection rates were not high on the whole.

    Salmonella; Infection; Antibody; Positive rate

    廣東省促進科技服務(wù)業(yè)發(fā)展計劃項目(2012B040302010);廣東省技術(shù)交易體系與科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)建設(shè)領(lǐng)域項目(2014B040404061,2016A040401012);廣東省科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才服務(wù)領(lǐng)域項目(2014A070713020)。

    呂殿紅(1969- ),女,安徽來安人,高級獸醫(yī)師,博士,從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者,研究員,博士,碩士生導(dǎo)師,從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

    2016-05-30

    S 85

    A

    0517-6611(2016)19-163-03

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