雪白彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化

周方元，蘇 丹，呂國忠，姜 娃，李琳琳

(大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連 116600)

?

雪白彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化

周方元，蘇 丹*，呂國忠，姜 娃，李琳琳

(大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連 116600)

[目的]探討雪白彎頸霉(Tolypocladiuminflatum)產(chǎn)環(huán)孢菌素的最適發(fā)酵條件。[方法]采用正交試驗，研究不同培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基種類、裝瓶量、菌種接種量(以菌片計)對雪白彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌素的影響。[結(jié)果]在培養(yǎng)時間為4 d，發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯200.00 g、甘露醇40.00 g、蛋白胨6.00 g，裝瓶量為100 mL，菌片投放為9片時雪白彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌素的發(fā)酵條件為最優(yōu)。[結(jié)論]試驗結(jié)果為提高雪白彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌的產(chǎn)量提供了理論依據(jù)。

雪白彎頸霉；環(huán)孢菌素；正交試驗；發(fā)酵條件

彎頸霉屬真菌是Gams基于3個土壤絲狀真菌建立的屬[1]。按傳統(tǒng)分類系統(tǒng)，彎頸霉屬真菌被劃歸于子囊菌門糞殼菌綱肉座菌目蟲草科[2-3]。Sung等[3]將麥角菌科分成麥角菌科、蟲草科和蛇形蟲草科3個科，并將彎頸霉屬劃歸到蛇形蟲草科。目前，已知某些彎頸霉是團(tuán)囊蟲草屬(Elaphocordyceps)的無性型，例如，雪白彎頸霉(Tolypoclamdiuinflatum)是冬蟲夏草(E.subsessilis)的無性型[4]；Quandt等[4-5]將蟲草屬及相近屬的26個種添加到彎頸霉屬中，因此，目前已知的彎頸霉屬真菌有41個分類單元。

環(huán)孢菌素A(CYA)最初是由瑞士科學(xué)家 Ruegger等[6]從挪威哈當(dāng)厄爾高原土壤中分離的雪白彎頸霉的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的。環(huán)孢菌素A 是一種重要的選擇性免疫抑制劑，臨床上作為器官移植的抗排斥藥物，在組織器官移植過程中排異反應(yīng)治療中有廣泛應(yīng)用，多用于角膜移植、腎移植等的治療，另外，對其他疾病如再生障礙性貧血等的治療也有研究[7]。 環(huán)孢菌素A 的制備、劑型及功效一直是研究的重點內(nèi)容，環(huán)孢菌素A產(chǎn)量的提高也是研究熱點[8]。鑒于此，筆者采用正交試驗研究了雪白彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌素的最佳發(fā)酵條件，以期為提高雪白彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌素產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。71株雪白彎頸霉為大連民族大學(xué)真菌資源與利用研究室保藏并提供。

1.1.2培養(yǎng)基?；罨囵B(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂20.00 g，加水定容至1 L。發(fā)酵培養(yǎng)基：(a)馬鈴薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，加水定容至1 L;(b)固體玉米漿粉30.00 g，糊精60.00 g，葡萄糖1.50 g，尿素0.15 g，加水定容至1 L，pH 4.5;(c)馬鈴薯200.00 g，甘露醇40.00 g，蛋白胨6.00 g，加水定容至1 L。

1.2方法

1.2.1菌種活化。從4 ℃冰箱中取出保存的菌種，恢復(fù)到室溫，然后將菌株分別轉(zhuǎn)接到90 mm PDA平皿上，25 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑取菌落邊緣的菌絲接種到新培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后，用直徑6 mm打孔器沿邊緣取相同菌齡的菌塊備用。

1.2.2產(chǎn)環(huán)孢菌素菌株初步篩選。將已經(jīng)活化的菌株分別與黑曲霉菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)，每個試驗重復(fù)3次，3 d后觀察，采用十字交叉法測量抑菌圈平均直徑[9]，比較菌株抑菌圈直徑大小，篩選出有明顯抑菌效果的菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)。采用正交設(shè)計法[10-12]研究4個因素，即發(fā)酵時間、發(fā)酵培養(yǎng)基種類、裝瓶量以及菌片投放量對發(fā)酵效果，即抑菌效果的影響[13]。每個因素3個水平，所列因素與水平見表1。選取L9(34)正交試驗表。用250 mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)物在26 ℃、200 r/min 的搖床振蕩培養(yǎng)。

表1　正交試驗因素與水平

1.2.4抑菌活性檢測。采用生物檢測方法，從雪白彎頸霉發(fā)酵液對黑曲霉有無抑制作用和抑制程度來確定其中環(huán)孢菌素的有無[14]。按照正交試驗設(shè)計，分別于4、6、8 d 取出三角瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)物，將其于12 000 r/min離心15 min后，去除沉淀，留下上清液備用。將滅菌的PDA培養(yǎng)基加熱融化，待培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃，將上清液與PDA培養(yǎng)基按1∶10比例混合均勻，再倒入平板中，每個處理3次重復(fù)。對照組采用等量的無菌水替換發(fā)酵液與PDA混合，靜置，冷卻。將培養(yǎng)2 d，未產(chǎn)孢的黑曲霉用6 mm的打孔器打出菌塊，將菌塊接種到發(fā)酵液與PDA混合的平板上，25 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄黑曲霉菌落平均直徑。

2　結(jié)果與分析

由圖1可知，試驗組的黑曲霉菌落直徑不相同，但是全部小于對照組的黑曲霉菌落直徑，說明雪白彎頸霉發(fā)酵液全部產(chǎn)生了環(huán)孢菌素，并且不同因素下產(chǎn)生環(huán)孢菌素的量也不相同。由表2可知，極差大小為RA>RB>RD>RC，因此，以抑菌效果為考察指標(biāo)，4個因素對彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌素發(fā)酵的影響程度大小依次為培養(yǎng)時間(A)、培養(yǎng)基種類(B)、菌片量(D)、裝瓶量(C)。同時，可以得到正交試驗范圍內(nèi)的最佳發(fā)酵條件為A1B3C1D3，即發(fā)酵天數(shù)為4 d，培養(yǎng)基為c，裝瓶量為100 mL，菌片投放量為9片。

圖1　對照組與試驗組黑曲霉菌落生長情況Fig.1　Growth situation of Aspergillus niger colonies in the CK and experimental group

試驗號Testnumber因素FactorABCD黑曲霉菌落平均直徑AveragediameterofA.nigercolonies∥cm111111.350212221.330313331.400421231.250522311.200623121.300731321.267832131.250933211.233K14.083.8763.9003.783K23.753.7803.8133.897K33.753.9333.8673.900R0.110.0510.0290.039

3　結(jié)論與討論

環(huán)孢菌素是一種有效的免疫抑制劑，隨著環(huán)孢菌素在國內(nèi)外臨床移植手術(shù)中的廣泛應(yīng)用，雪白彎頸霉作為環(huán)孢菌素高產(chǎn)菌株的一員，其發(fā)酵條件的研究也成為熱點。該研究采用正交試驗法得出，發(fā)酵時間是影響雪白彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌素的最重要因素，在發(fā)酵時間為4 d時環(huán)孢菌素的產(chǎn)量最大，與梁建描述發(fā)酵時間不一致。梁建采用種子液發(fā)酵，培養(yǎng)基中加入0.1%的磷酸二氫鉀，由于發(fā)酵菌種添加形式和培養(yǎng)基的不同，導(dǎo)致雪白彎頸霉產(chǎn)環(huán)孢菌素最佳發(fā)酵條件不同。

[1] GAMS W.Tolypocladium，eine Hyphomycetengattung mit geschwollenen Phialiden[J].Persoonia，1971，6：185-191.

[2] GAZIS R，SKALTSAS D，CHAVERRI P.Novel endophytic lineages ofTolypocladiumprovide new insights into the ecology and evolution ofCordyceps-like fungi[J].Mycologia，2014，106(6)：1090-1105.

[3] SUNG G H，HYWEL-JONES N L，SUNG J M，et al.A multi-gene phylogeny ofClavicipitaceae(Ascomycota，F(xiàn)ungi)：Identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approach[J].Elsevier，2007，44：1204-1223.

[4] HODGE K T，KRASNOFF S B，HUMBER R A.Tolypocladiuminflatumis the anamorph ofCordycepssubsessilis[J].Mycologia，1996，88(5)：715-719.

[5] QUANDT C A，KEPLER R M，GAMS W，et al.Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae(Hypocreales)with new combinations inTolypocladium[J].IMA Fungus，2014，5(1)：121-134.

[6] 張之萌.新型免疫抑制劑：環(huán)孢菌素A[J].抗生素，1986，11(5)：448-460.

[7] 王維，蔡銀燕，陳耀.環(huán)孢菌素a的作用機制及臨床應(yīng)用[J].海峽藥學(xué)，2007(10)：103-105.

[8] 廖福榮.環(huán)孢菌素A高產(chǎn)的Tolypocladiuminflatum融合株的選育[J].國外醫(yī)藥(抗生素分冊)，1998，19(1)：25-26.

[9] 范秀芝，陳麗冰，史徳芳，等.黑木耳液體發(fā)酵菌株篩選及發(fā)酵特性分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54(20)：5117-5120.

[10] 羅宇煊，張甲耀，龔利萍，等.正交實驗選擇嗜堿細(xì)菌降解木質(zhì)素的最優(yōu)綜合培養(yǎng)條件[J].環(huán)境科學(xué)，2001，22(5)：95-98.

[11] 王暉，張麗艷，楊衛(wèi)平，等.正交實驗法優(yōu)化疏毛吳茱萸提取工藝[J].藥物研究，2010，25(8)：52-53.

[12] 朱良，張青，王一飛，等.正交實驗法優(yōu)選繁枝蜈蚣藻粗多糖的提取工藝[J].食品科學(xué)，2006，27(2)：151-154.

[13] 梁建.雪白彎頸霉液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件的研究[J].大連民族學(xué)院學(xué)報，2005，7(9)：7.

[14] 金琎.環(huán)孢菌素的提取與菌株選育[J].鐵道師院學(xué)報，1991(S1)：44-50.

Optimization of Fermentation Conditions for Production of Cyclosporin fromTolypocladiuminflatum

ZHOU Fang-yuan, SU Dan*, LU Guo-zhong et al

(College of Environment and Resources, Dalian Nationalities University, Dalian, Liaoning 116600)

[Objective] To discuss the optimum fermentation conditions for the production of cyclosporin fromTolypocladiuminflatum. [Method] Through an orthogonal experiment, the effects of culture time, culture medium, bottling capacity, and inoculation amount (in slice) ofT.inflatumon the production of cyclosporin were analyzed. [Result] The optimum fermentation conditions for the production of cyclosporin fromT.inflatumwere shown as follows: the culture time was 4 d; the fermentation culture medium was composed of potato 200.00 g, mannitol 40.00 g, and peptone 6.00 g; bottling capacity was 100 mL; inoculation amount was 9 slices. [Conclusion] The study can provide theoretical foundation for the improvement of yield of cyclosporin produced fromT.inflatum.

Tolypocladiuminflatum; Cyclosporin; Orthogonal experiment; Fermentation conditions

大連民族大學(xué)人才引進(jìn)科研項目啟動基金項目(0701-110048)；中央高校自主科研基金項目(DC201502070402)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(XA201612317，XA201612315)。

周方元(1992- )，女，河北滄州人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者，講師，博士，從事真菌多樣性研究。

2016-05-30

R 927.2

A

0517-6611(2016)19-008-02