張海天 王國祥 尹榮 邱滿堂 許林
長非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)廣泛參與了各種生理和疾病過程,在肺癌的發(fā)生和進展過程中也發(fā)揮著重要的調控作用[1,2]。MALAT1是肺癌中最早被鑒定的lncRNA之一,也是肺癌研究領域中研究最多的lncRNA之一,很多研究都證實MALAT1可以促進肺癌的惡性進展[3-5]。
MALAT1在肺癌中的分子機制目前已有相關報道,但是對MALAT1與微小RNA(microRNA, miRNA)的相互調控關系的研究尚少[6,7]。此外目前關于MALAT1與miRNA的研究多是集中在miRNA對MALAT1表達的負性調控[7],而MALAT1對miRNA表達的調控作用尚未見系統(tǒng)性研究。因此,本研究旨在通過實驗和生物信息手段,系統(tǒng)性地研究MALAT1調控的miRNA。
1.1 實驗材料 A549細胞購買于中國科學院上海細胞庫,H1640培養(yǎng)基購于南京凱基公司,RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司,逆轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購于Takara公司,TaqMan Low Density Array(TLDA)芯片購于AppliedBiosystems公司,轉染試劑Lipo2000購于Invitrogen公司。實驗所用引物和反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)于南京金斯瑞公司合成,MAL AT1引物序列:上游5’-GGATCCTAGACCAGCATGCC-3’,下游5’-AAAGGTTACCATAAGTAAGTTCCAGAAAA-3’;β-肌動蛋白引物序列上游:5’-GAAATCGTGCGTGACATTAA-3’,下游:5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。ASO序列:ASO1:5’-ATGGAGGTATGACATATAAT-3’,ASO2:5’-TCTTATGTTTCCGAACCGTT-3’[3,4]。
1.2 細胞培養(yǎng)與轉染 A549細胞培養(yǎng)在10%FBS的H1640培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。將A549細胞接種于六孔板中轉染,使用Lipo2000試劑以終濃度100 nmol/L轉染ASO[4,8]。RT-PCR法檢測MALAT1表達:A549細胞轉染24 h后使用Trizol法提取總RNA,根據試劑盒說明進行逆轉錄反應。RT-PCR反應體系:cDNA 0.5 μL、水3.7 μL、上下游引物各0.4 μL、2×reaction mix 5 μL,使用ABI 7900儀器進行RT-PCR反應,每組實驗均以β-actin作為內參[9,10]。
1.3 TaqMan Low Density Array(TLDA)實驗 A549細胞轉染后提取總RNA并逆轉錄,使用ABI 7900儀器根據制造商說明書進行TLDA芯實驗,使用制造商提供的RQ manage軟件進行數(shù)據分析。
1.4 基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA) 將差異表達基因按照差異倍數(shù)從高到低排序,使用GSEA軟件中的GseaPreranked選項進行數(shù)據分析,miRNA基因集注釋文件下載自GSEA網站[11]。
1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件完成統(tǒng)計分析。使用Student’st檢驗計算MALAT1表達差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 在A549細胞中敲減MALAT1 在A549細胞中轉染診斷MALAT1的ASO序列和陰性對照序列(scramble),與對照組相比,轉染ASO1和ASO2后MALAT1表達被下調,且ASO1效果更佳(圖1A)。
2.2 TLDA實驗 使用ASO1在A549細胞中敲減MALAT1,通過TLDA實驗檢測miRNA表達變化,以P<0.05為篩選標準,共發(fā)現(xiàn)131個上調、22個下調的miRNA。
2.3 GSEA分析 GutschnerT在A549細胞中敲減MALAT1后通過基因表達譜芯片發(fā)現(xiàn)458個差異表達基因[3],本研究對這些差異表達基因進行GSEA分析,發(fā)現(xiàn)有多個miRNA在這些差異表達基因中被顯著富集。
2.4 MALAT1調控的miRNA 將TLDA得到的差異表達miRNA和GSEA富集的miRNA取交集,獲得45個miRNA,進一步篩選表達與調控關系相符的miRNA,最終獲得28個被MALAT1調控的miRNA(表1,圖1B)。根據MALAT1與這些miRNA的表達關系,我們構建了MALAT1-miRNA調控網絡(圖1C)。
MALAT1是2004年Ji等[12]發(fā)現(xiàn)的、一個長8,556核苷酸的反義lncRNA,MALAT1位于11號染色體。MALAT1在肺癌組織中顯著高表達,且MALAT1高表達提示患者預后不良[13],同時體內和體外實驗都證實MALAT1可以促進肺癌細胞侵襲和增殖能力[1,14]。在食管癌、胃癌、肝癌等其他腫瘤中,MALAT1也發(fā)揮著促癌基因作用[15-17]。
圖1 相對于陰性對照序列(scramble),ASO1和ASO2抑制了MALAT1表達水平,ASO1下調作用更佳,*P<0.05(A);28個miRNA在TLDA芯片中表達水平,紅色表達上調,綠色表達下調(B);MALAT1和miRNA調控網絡,藍色:MALAT1,綠色:敲減MALAT1后表達上調miRNA,紅色:敲減MALAT1后表達下調的miRNA(C)。Fig 1 ASO1 and ASO2 significantly inhibited MALAT1 expression level, compared with scramble sequence, and ASO1 showed better inhibitory effect. *P<0.05 (A). Expression level of the 28 miRNAs in TLDA results, red: up-regulation, green: down-regulation (B); regulatory network of MALAT1 and miRNAs; blue: MALAT1, green: miRNAs up-regulated after MALAT1 knockdown, red: miRNAs down-regualted after MALAT1 knockdown.
關于MALAT1的分子生物學機制已有較多研究,但是對于MALAT1調控miRNA方面研究較少。本研究首先設計并合成了特異性靶向MALAT1的ASO,并有效的敲減了MALAT1的表達。通過TLDA芯片,發(fā)現(xiàn)敲減MALAT1之后很多miRNA表達發(fā)生顯著變化,證實MALAT1會影響miRNA表達,提示miRNA可能通過調控miRNA表達來發(fā)揮生物學功能。Gutschner等[3]通過ZFN技術敲減了MALAT1,并發(fā)現(xiàn)了458個差異表達基因,我們使用GSEA方法分析了這些差異表達基因,尋找這些基因中被富集的miRNA結合位點。GSEA可以分析一個預先定義的基因集是否被富集[9]。敲減MALAT1后miRNA表達下調,則miRNA靶基因表達上調;對差異表達基因GSEA分析,miRNA會被正性富集。因此,在對TLDA和GSEA取交集的45個miRNA中進一步篩選出下調-正性富集和上調-負性富集的28miRNA,即這28個miRNA是被MALAT1調控的miRNA。
Tripathi等[4]首先報道MALAT1可以影響RNA剪切,而后Gutschner等[3]通過芯片分析發(fā)現(xiàn)MALAT1敲減之后對RNA剪切影響不大,而對基因表達水平有重要影響,提示MALAT1可以調控基因轉錄。之后,諸多研究[17,18]發(fā)現(xiàn)MALAT1可以通過與RNA結合蛋白綁定調控下游基因的轉錄。因此MALTA1也可能通過與RNA結合蛋白綁定直接調控miRNA轉錄;此外,受MALAT1調控的基因也可能間接調控miRNA表達。然而,對于本研究鑒定出的28個miRNA,還需進一步實驗來明確MALAT1具體是通過何種機制調控這些miRNA的表達。
表1 28個MALAT1調控的miRNATab 1 28 miRNAs regulated by MALAT1
本研究通過實驗和生物信息學分析手段、系統(tǒng)性地研究了MALTAT1調控的miRNA,為進一步研究MALAT1和miRNA的調控網絡提供了參考。