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    SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導的軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

    2016-08-24 09:53:22史棟梁郭會卿
    中國病理生理雜志 2016年7期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)霉素軟骨

    謝 靜, 史棟梁, 郭會卿

    (河南省中醫(yī)院風濕骨病科,河南鄭州450002)

    SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導的軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

    謝 靜, 史棟梁, 郭會卿△

    (河南省中醫(yī)院風濕骨病科,河南鄭州450002)

    目的:探究固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP-2)對衣霉素誘導的軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的影響。方法:分離人正常軟骨細胞和骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細胞培養(yǎng),衣霉素和SREBP-2 siRNA分別處理正常軟骨細胞。24 h后,實時熒光定量PCR檢測對微小RNA-185(miR-185)表達的影響,流式細胞術(shù)檢測對細胞凋亡的影響,Western blot法檢測對SREBP-2、CHOP、p-eIF2α和ATF4等ERS相關(guān)蛋白,Bcl-2、Bax和caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白水平的影響;caspase-3活性試劑盒檢測對細胞caspase-3活性的影響。結(jié)果:與對照組相比,OA組和衣霉素組SREBP-2表達增加,miR-185表達降低(P<0.05)。SREBP-2 siRNA轉(zhuǎn)染可明顯阻斷衣霉素引起的miR-185降低(P<0.05)。miR-185過表達能夠下調(diào)SREBP-2蛋白水平(P<0.05)。與對照組相比,OA組和衣霉素組CHOP、peIF2α和ATF4的蛋白水平明顯上調(diào),Bcl-2表達下調(diào),Bax和caspase-3表達增加(P<0.05);SREBP-2沉默處理則顯著逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(P<0.05)。細胞凋亡率與上述細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化趨勢一致(P<0.05)。與衣霉素組相比,SREBP-2 siRNA轉(zhuǎn)染明顯下調(diào)caspase-3活性,miR-185抑制則明顯逆轉(zhuǎn)上述作用(P<0.05)。結(jié)論: SREBP-2沉默可通過上調(diào)miR-185抑制衣霉素誘導的軟骨細胞ERS和細胞凋亡。

    固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2;衣霉素;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;軟骨細胞;微小RNA-185

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種常見的以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征,并伴隨關(guān)節(jié)周圍滑膜炎癥的慢性關(guān)節(jié)疾病。研究表明,軟骨細胞凋亡為軟骨退變的主要誘因和分子生物學基礎(chǔ)。其中,氧化損傷、炎癥損傷、免疫功能失衡等病理機制在該病發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是由各種刺激引起的亞細胞器病理狀態(tài),因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯誤折疊蛋白積聚而產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)。文獻顯示,衣霉素(tunicamycin,Tuni)處理的軟骨細胞可作為研究OA疾病發(fā)展的細胞模型[1],衣霉素通過引起ERS導致軟骨細胞凋亡[2]。因此,可通過阻斷ERS,減少軟骨細胞凋亡,進而降低OA患者的軟骨缺失,最終防治OA發(fā)生與發(fā)展。

    最新研究表明,OA可能是一種代謝類疾?。?]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory elementbinding proteins,SREBPs)是調(diào)節(jié)脂類代謝的轉(zhuǎn)錄因子,在膽固醇穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。有報道SREBP-2與OA病理過程相關(guān)[4]。因此,本實驗旨在探究SREBP-2對衣霉素誘導的軟骨細胞ERS和細胞凋亡的影響以及相關(guān)機制。

    材料和方法

    1 材料與試劑

    衣霉素(Sigma);Lipofectamine 2000、胰酶(Invitrogen);胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco);微小 RNA-185(micro-RNA-185,miR-185)熒光定量PCR檢測試劑盒(Gene Copia);BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo);6孔板(Corning);ECL、caspase-3活性檢測試劑盒、HRP標記的山羊抗鼠II抗和山羊抗兔II抗(碧云天生物技術(shù)研究所);anti-miR-185 mimics和scrambled mimics(銳博生物公司);靶向人SREBP-2 siRNA、scrambled siRNA以及兔多抗Bcl-2、Bax、β-actin、ATF4和CHOP (Santa Cruz);兔多抗caspase-3(Upstate);兔單抗peIF2α(CST);0.2%Ⅱ型膠原酶(Millipore);其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

    2 方法

    2.1 軟骨細胞的分離、培養(yǎng)和傳代 正常軟骨細胞和OA軟骨細胞分別來自河南中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷截肢患者和OA行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者,此過程均得到河南中醫(yī)學院倫理委員會批準和患者完全知情同意。術(shù)中無菌條件下削取足量關(guān)節(jié)面軟骨,移至無血清DMEM/F12培養(yǎng)基,冰上保存。去除多余組織,切成小顆粒,PBS洗滌后,加入0.25%胰蛋白酶液,37℃搖床中放置30 min。棄酶液,PBS洗3次。加入0.2%Ⅱ型膠原酶溶液,37℃搖床中放置4 h。120目篩網(wǎng)過濾,收集懸液。1 000 r/min離心7 min,PBS洗3次后,用含10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),隔天換液,保持培養(yǎng)條件穩(wěn)定。

    2.2 細胞分組處理及轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)軟骨細胞分為OA軟骨細胞組、正常軟骨細胞組、衣霉素組、SREBP-2 siRNA組和衣霉素+SREBP-2 siRNA組。將軟骨細胞按每孔4×105接種6孔板,按照Lipofectamine 2000說明書,分別將 50 nmol/L SREBP-2 siRNA、scrambled siRNA、anti-miR-185 mimics和 scrambled mimics轉(zhuǎn)染正常軟骨細胞。48 h后,進行實驗處理。各組細胞用相應(yīng)處理的培養(yǎng)基孵育時間一致。無水乙醇配制衣霉素儲液,實驗前用含0.5%FBS培養(yǎng)基稀釋至0.5 mg/L。

    2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞miR-185的表達 將軟骨細胞或者轉(zhuǎn)染后軟骨細胞按每孔4×105個接種6孔板,過夜后無血清處理。12 h后,向各組分別加相應(yīng)處理的培養(yǎng)液。miR-185表達的檢測嚴格按microRNA檢測試劑盒說明書進行。

    2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將軟骨細胞或者轉(zhuǎn)染后軟骨細胞按每孔4×105個的密度接種6孔板,過夜后無血清處理。12 h后,向各組分別加相應(yīng)處理的培養(yǎng)液。作用24 h后收集細胞,預(yù)冷PBS洗滌,加入預(yù)冷75%乙醇,4℃固定4 h以上。離心棄上清,PBS洗滌后,加入500 μL binding buffer懸浮細胞。加入5 μL Annexin V-EGFP混勻后,再加入5 μL PI,混勻。室溫、避光、反應(yīng)5~15 min。1 h內(nèi),上機流式細胞儀檢測分析。

    2.5 Western blot檢測細胞相關(guān)蛋白表達 將軟骨細胞或者轉(zhuǎn)染后軟骨細胞按每孔4×105接種6孔板,過夜后無血清處理。12 h后,向各組分別加相應(yīng)處理的培養(yǎng)液。作用24 h后收集細胞,加RIPA裂解液,提取細胞全蛋白。經(jīng)BCA定量、上樣、SDSPAGE分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、I抗孵育、II抗孵育和ECL顯影等步驟,檢測各組細胞相關(guān)蛋白表達。

    2.6 Caspase-3活性的檢測 獲取細胞裂解液,置于冰上,按試劑盒說明進行操作,使用酶標儀在405 nm處測定caspase-3的活性。

    3 統(tǒng)計學處理

    實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,多組間比較用單因素方差分析,各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié)果

    1 SREBP-2和miR-185在軟骨細胞中的表達

    通過酶兩步消化法成功獲得原代人正常軟骨細胞和OA軟骨細胞。與正常軟骨細胞對照組相比,OA組和衣霉素組SREBP-2蛋白表達顯著增加,miR-185水平顯著降低(P<0.05),見圖1。

    Figure 1.The expression of SREBP-2 and miR-185 in the normal chondrocytes and OA chondrocytes.Tuni:tunicamycin.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs OA group;#P<0.05 vs control group.圖1 SREBP-2和miR-185在正常軟骨細胞和OA軟骨細胞中的表達

    2 衣霉素處理下SREBP-2和miR-185表達相互調(diào)節(jié)

    SREBP-2 siRNA轉(zhuǎn)染正常軟骨細胞可顯著降低SREBP-2蛋白表達,上調(diào)miR-185水平(P<0.05)。與正常軟骨細胞對照組相比,OA組和衣霉素組miR-185水平降低,SREBP-2蛋白水平增加,SREBP-2 siRNA轉(zhuǎn)染則明顯上調(diào)miR-185水平(P<0.05),miR-185過表達則下調(diào)衣霉素誘導的SREBP-2蛋白水平(P<0.05)。可見,衣霉素處理下,SREBP-2和miR-185表達相互影響,相互調(diào)節(jié),見圖2。

    Figure 2.SREBP-2 and miR-185 expression interacted with each other in the normal chondrocytes with tunicamycin(Tuni)treatment.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs OA group;#P<0.05 vs control group.圖2 衣霉素處理下正常軟骨細胞SREBP-2和miR-185表達相互影響

    3 SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導的ERS

    Western blot結(jié)果顯示,與正常軟骨細胞對照組相比,OA組和衣霉素組CHOP、p-eIF2α和ATF4蛋白表達顯著增加,SREBP-2沉默則作用相反。而且SREBP-2沉默顯著下調(diào)衣霉素誘導的ERS相關(guān)蛋白表達(P<0.05),見圖3。

    Figure 3.The effects of tunicamycin(Tuni)and SREBP-2 silencing on ERS in the normal chondrocytes.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs OA group;#P<0.05 vs control group.圖3 衣霉素和SREBP-2沉默處理對正常軟骨細胞ERS的影響

    4 SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導的細胞凋亡

    Western blot結(jié)果顯示,與正常軟骨細胞對照組相比,OA組和衣霉素組Bax和caspase-3蛋白表達顯著升高,Bcl-2蛋白表達顯著減少(P<0.05); SREBP-2沉默組則作用相反。而且SREBP-2沉默處理可顯著抑制衣霉素引起的細胞凋亡(P<0.05)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,細胞凋亡率與上述細胞凋亡相關(guān)蛋白表達趨勢一致(P<0.05),見圖4。

    5 抑制miR-185表達可阻斷SREBP-2沉默引起的軟骨細胞caspase-3活性降低

    與正常軟骨細胞對照組相比,OA組和衣霉素組細胞相對caspase-3活性明顯升高。而SREBP-2 si RNA轉(zhuǎn)染明顯下調(diào)衣霉素引起的細胞相對caspase-3活性升高,miR-185抑制則阻斷SREBP-2沉默引起的軟骨細胞caspase-3活性降低(P<0.05),見圖5。

    討論

    OA是一種衰老性疾病,是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因。該病最早最主要的病理變化是由關(guān)節(jié)軟骨起始,影響包括軟骨下骨、滑膜、關(guān)節(jié)囊、肌腱韌帶及周圍肌肉組織在內(nèi)的整個關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu),導致關(guān)節(jié)軟骨全部脫失,最終關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。若OA患者能早期確診并進行干預(yù),可避免關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能進一步惡化,降低中晚期OA發(fā)生率和致殘率。因此,尋找新的OA分子標記將有助于OA的早期診斷、治療和發(fā)病機制的研究。

    軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中惟一細胞類型,在維持正常軟骨代謝中具有關(guān)鍵作用。軟骨細胞凋亡引起的細胞數(shù)目減少是OA最主要的病理表現(xiàn)之一,進而導致OA發(fā)生。細胞凋亡主要通過死亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑等3種信號通路發(fā)生。適度ERS具有細胞保護作用,過高和持久的ERS則可通過誘導ERS相關(guān)蛋白表達和激活相關(guān)信號通路,導致細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),ERS引起的軟骨細胞凋亡促進關(guān)節(jié)軟骨退化[2]。SREBP-2在OA軟骨細胞中高表達,與OA病理過程密切相關(guān)[4]。miR-185在多種癌組織中低表達[5],miR-185下調(diào)可作為人軟骨肉瘤診斷和預(yù)后的潛在生物標記[6],而且miR-185可抑制衣霉素誘導的ERS[7]。本研究表明,與人正常軟骨細胞相比,OA對照組和衣霉素組SREBP-2表達增加,miR-185降低;SREBP-2沉默可顯著上調(diào)衣霉素引起的miR-185降低。

    SREBPs是與固醇調(diào)節(jié)元件DNA序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,能激活膽固醇代謝和生物合成基因[8],促進低密度脂蛋白攝取[9]。研究發(fā)現(xiàn),SREBP-2通過與Smad3相互作用,參與調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨主要結(jié)構(gòu)成分的形成[10]。ERS可誘導SREBP-2激活和細胞凋亡,引發(fā)腎臟近曲小管細胞損傷[11]。此外,miR-185具有心肌保護作用,能抑制ERS誘導的心肌細胞凋亡[7]。文獻進一步表明,miR-185可通過調(diào)控肝細胞中SREBP-2及相關(guān)聯(lián)基因的表達和活性,維持膽固醇穩(wěn)態(tài),且SREBP-2的調(diào)節(jié)作用依賴于miR-185表達,SREBP-1c能通過膽固醇反應(yīng)反饋回路調(diào)節(jié)miR-185表達[9]。miR-185能通過下調(diào) SREBP-1和SREBP-2及其靶基因表達,調(diào)控前列腺癌細胞中脂肪生成和膽固醇產(chǎn)生,引發(fā)caspase依賴性的細胞凋亡,抑制腫瘤進程[12]。本研究亦發(fā)現(xiàn),OA組和衣霉素處理組軟骨細胞CHOP、p-eIF2α和ATF4上調(diào),Bcl-2表達下調(diào),Bax和caspase-3表達明顯增加,miR-185水平下調(diào);SREBP-2沉默則顯著抑制衣霉素引起的ERS升高和凋亡增加,并上調(diào)miR-185水平。而且,miR-185過表達下調(diào)衣霉素引起的SREBP-2增加,miR-185抑制則阻斷SREBP-2沉默引起的軟骨細胞 caspase-3活性降低??梢?,SREBP-2和miR-185之間相互影響,相互調(diào)節(jié),在衣霉素誘導的軟骨細胞ERS和細胞凋亡過程中共同發(fā)揮著重要作用。

    Figure 4.The effects of tunicamycin(Tuni)and SREBP-2 silencing on the apoptosis of the normal chondrocytes.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs OA group;#P<0.05 vs control group.圖4 衣霉素和SREBP-2沉默處理對正常軟骨細胞細胞凋亡的影響

    Figure 5.The effects of tunicamycin(Tuni),SREBP-2 silencing and miR-185 inhibition on caspase-3 activity in the normal chondrocytes.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs OA group;#P<0.05 vs control group.圖5 衣霉素、SREBP-2沉默和miR-185抑制處理對正常軟骨細胞caspase-3活性的影響

    綜上所述,本實驗初步探究發(fā)現(xiàn)SREBP-2沉默可通過上調(diào)miR-185抑制衣霉素誘導的軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細胞凋亡。但是SREBP-2沉默在軟骨細胞凋亡中的作用以及調(diào)控OA進程的分子機制仍需進一步研究。SREBP-2有望成為針對OA疾病的分子作用靶點,亦為其它衰老相關(guān)性疾病的預(yù)防和治療提供新思路。

    [1] Liu F,Weng X,Lin P,et al.Duhuo Jisheng decoction inhibits endoplasmic reticulum stress in chondrocytes induced by tunicamycin through the downregulation of miR-34a[J].Int J Mol Med,2015,36(5):1311-1318.

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    (責任編輯:陳妙玲,羅 森)

    Effect of SREBP-2 silencing on tunicamycin-induced endoplasmic reticulum stress in chondrocytes

    XIE Jing,SHI Dong-liang,GUO Hui-qing

    (Department of Rheumatism Bone Disease,Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450002,China.E-mail:qujining@yeah.net)

    AIM:To explore the effect of sterol regulatory element-binding protein 2(SREBP-2)on tunicamycin-induced endoplasmic reticulum stress(ERS)in chondrocytes.METHODS:After isolation of human normal chondrocytes and osteoarthritis(OA)chondrocytes,the normal cells were cultured and treated with tunicamycin and SREBP-2 siRNA.After 24 h treatment,fluorescent quantitative RT-PCR(RT-qPCR)was applied to quantify microRNA-185(miR-185)levels.The cell apoptotic rate was determined by flow cytometry.The expression of SREBP-2 and ERS-related proteins,C/EBP homologous protein(CHOP),phosphorylated eukaryotic initiation factor-2 α(p-eIF2α)and activating transcription factor 4(ATF4),and the expression of apoptosis-related proteins,Bcl-2,Bax and caspase-3,were determined by Western blot.The caspase-3 activity kit was used to determine the caspase-3 activity.RESULTS:Compared with human normal chondrocytes,both SREBP-2 up-regulation and miR-185 down-regulation were observed in OA chondrocytes (P<0.05).SREBP-2 siRNA transfection enhanced tunicamycin-inhibited miR-185 level(P<0.05).miR-185 overexpression reduced tunicamycin-induced SREBP-2 expression(P<0.05).OA control group and tunicamycin treatment group consistently resulted in ERS and cell apoptosis with concomitant enhancement of CHOP,p-eIF2α and ATF4 proteins,increases in Bax and caspase-3 proteins,and reduction of Bcl-2(P<0.05).However,SREBP-2 silencing significantly reversed these effects(P<0.05).The apoptotic rates were consistent with the expression tendency of apoptosis-related proteins(P<0.05).SREBP-2 siRNA transfection markedly down-regulated tunicamycin-induced caspase-3 activity,which was notably blocked by miR-185 inhibition(P<0.05).CONCLUSION:SREBP-2 silencing may inhibit tunicamycin-induced ERS and cell apoptosis via up-regulating miR-185 expression.

    Sterol regulatory element-binding protein 2;Tunicamycin;Endoplasmic reticulum stress;Chondrocytes;MicroRNA-185

    R684.3;R363

    A

    10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.022

    1000-4718(2016)07-1291-06

    2016-01-28

    2016-05-10

    △Tel:0371-60979803;E-mail:qujining@yeah.net

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